肺腺癌中缺氧诱导因子-1α调控程序性死亡因子配体1的表达

摘要

研究背景及目的：
　　非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)是全球范围内常见的恶性肿瘤，约占肺癌总数的85％[1]。肺腺癌是非小细胞肺癌的一种重要的病理类型，发病率呈逐年上升趋势[2]。肿瘤细胞免疫逃逸是目前的研究热点，程序性死亡因子1（programmed death-1，PD-1）及其配体程序性死亡因子配体1(programmed deathligand1，PD-L1)是参与肿瘤免疫逃逸的重要分子，在多种肿瘤中高表达[3]。目前针对PD-1/PD-L1免疫检查位点的单抗如nivolumab、pembrolizumab、atezolizumab等已应用于非小细胞肺癌临床试验和治疗，并取得了令人欣喜的临床效果[4-6]，但仍存在一些急需解决的问题，如较多患者对药物没有反应性、影响药物疗效的机制不明确等[7-8]。因此，研究肿瘤中PD-L1表达特征和相关调控机制及其在PD-1/PD-L1阻断治疗中的预测和预后价值具有重要临床意义[9]。缺氧是实体瘤微环境的重要生物学特征[10]，广泛存在于大多数实体瘤中的缺氧诱导因子1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)是一种转录调节因子，由HIF-1α亚单位和HIF-1β亚单位组成，其中HIF-1α是氧调节单位，是调控肿瘤细胞多种基因转录和蛋白表达适应缺氧环境的重要因子。近两年来，有研究报道缺氧条件下HIF-1α可调控PD-L1的表达[11-14]。然而，肺腺癌中PD-L1的表达是否受缺氧微环境及HIF-1α调控影响尚无报道。
　　本实验拟通过免疫组化法分析临床肺腺癌组织标本中HIF-1α、PD-L1表达相关性，并利用癌症基因组图谱计划(the cancer genome atlas，TCGA)数据库验证组化结果，及分别用CoCl2模拟化学性缺氧和siRNA沉默HIF-1α处理人肺腺癌细胞系，探究肺腺癌中HIF-1α对PD-L1表达的调控作用和机制。
　　研究方法：
　　应用免疫组织化学方法检测99例肺腺癌组织中HIF-1α、PD-L1的表达;利用TCGA数据库分别分析230名肺腺癌患利者[15]和178名肺鳞癌患者[16]数据组中HIF-1α、PD-L1 mRNA表达相关性;CoCl2模拟化学性缺氧分别处理人肺腺癌细胞NCI-H1975和HCC827，实验分为Normal组、CoCl2组，qRT-PCR检测HIF-1α、PD-L1 mRNA表达，Western blotting检测HIF-1α、PD-L1蛋白表达;siRNA-HIF-1α分别瞬时转染人肺腺癌细胞NCI-H1975和HCC827，分为NC组、siR-HIF-1α组，qRT-PCR、Westernblotting检测转染效率及PD-L1 mRNA和蛋白的表达。
　　结果：
　　1.免疫组化检测结果显示，肺腺癌组织中HIF-1α阳性表达呈棕褐色细颗粒，染色定位于细胞核。PD-L1阳性表达呈棕黄色颗粒，染色定位于细胞膜和（或）细胞质。99例肺腺癌组织中，HIF-1α、PD-L1阳性率分别为47.48％(47/99)、34.34％(34/99)。2.99例肺腺癌组织中，HIF-1α表达水平与患者年龄和临床分期有关(P＜0.05)，与性别、吸烟状况、肿瘤大小、淋巴结转移均无关（P＞0.05）。
　　3.99例肺腺癌组织中，PD-L1表达水平与患者临床分期有关（P＜0.05），与年龄、性别、吸烟状况、肿瘤大小、淋巴结转移均无关（P＞0.05）。
　　4.Spearman相关分析法分析免疫组化结果显示，肺腺癌中HIF-1α蛋白表达和PD-L1蛋白表达正相关（r=0.292，P＜0.01）。进一步分析TCGA数据库中230名肺腺癌患者组HIF-1α和PD-L1 mRNA表达水平，发现与组化结果一致，肺腺癌中HIF-1α和PD-L1 mRNA表达正相关（r=0.467，P＜0.001）。此外，我们还分析了TCGA数据库中178名肺鳞癌患者组HIF-1α和PD-L1 mRNA表达水平，发现肺鳞癌中HIF-1α和PD-L1 mRNA表达无相关性（r=0.108，P＞0.05）。
　　5.CoCl2模拟化学性缺氧处理肺腺癌细胞NCI-H197524h后，与Normal组相比，CoCl2组HIF-1α蛋白表达水平明显升高(P＜0.05)，PD-L1 mRNA及蛋白表达水平随之明显升高(P＜0.01); CoCl2模拟化学性缺氧处理肺腺癌细胞HCC82724h后，与Normal组相比，CoCl2组HIF-1α蛋白表达水平明显升高(P＜0.05)，PD-L1 mRNA及蛋白表达水平随之明显升高（P＜0.05）。
　　6.siRNA转染沉默肺腺癌细胞NCI-H1975 HIF-1α基因，48h后检测转染效率确保HIF-1α基因表达下调，进一步检测PD-L1表达变化发现，siR-HIF-1α组与NC组相比，PD-L1 mRNA及蛋白表达水平显著降低(P＜0.05); siRNA转染沉默肺腺癌细胞HCC827 HIF-1α基因，48h后检测转染效率确保HIF-1α基因表达下调，迸一步检测PD-L1表达变化发现，siR-HIF-1α组与NC组相比，PD-L1 mRNA及蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。
　　结论：
　　本研究发现在临床肺腺癌组织标本中HIF-1α和PD-L1蛋白表达正相关，进一步在TCGA数据库中验证了肺腺癌中HIF-1α和PD-L1 mRNA表达正相关，并在肺腺癌细胞实验中证明了HIF-1α对PD-L1的表达起到调控促进作用，揭示了肺腺癌肿瘤缺氧微环境导致肿瘤免疫逃逸的一种重要机制。

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