EGCG通过抑制内质网应激凋亡途径减轻高糖致足细胞损伤

摘要

研究背景及目的:
　　糖尿病(diabetes，DM)发病率随着当代生活方式的改变逐年增加，糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是DM最严重的慢性微血管并发症之一，其患病率也随之升高。在终末期肾衰竭(end-stage renal disease，ESRD)患者中由DN所占的比例也逐年增加。足细胞是不可再生的高度分化细胞，研究证明足细胞的损伤和凋亡在DN的发病和进展机制中占有重要地位。细胞在高糖环境下发生形态和结构改变如肥大、足突分离、足细胞表面蛋白丢失、严重可致足细胞发生凋亡。其中凋亡与DN的发病机制密切相关。内质网是多功能细胞器，除参与机体物质合成代谢外，在维持细胞内环境稳态中也起着重要的调节作用。高糖、氧化应激等作用于内质网时，持续的有害因素会启动内质网凋亡程序使细胞发生凋亡。表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechi-3-gallate，EGCG)是绿茶中含有茶多酚，研究表明EGCG在肿瘤、脑血管病、冠心病等慢性疾病发挥重要的预防作用。但EGCG是否对糖尿病肾病具有预防作用及是否具有保护足细胞的作用至今未见明确报道。在该实验中通过高糖诱导足细胞，建立细胞凋亡模型，比较EGCG干预前后足细胞的增殖能力、足细胞表面蛋白Nephrin和WT-1的表达、足细胞的凋亡、内质网蛋白分子葡萄糖调节蛋白78(glucose regulatingprotein，GRP78)、磷酸化蛋白激酶样ER激酶(p-double-stranded RNA likeendoplasmic reticulum kinase p-PERK)半胱氨酸天冬氨酸酶12(cysteinyaspartate-specific proteinases，Caspase-12)的表达情况。目的在于探究EGCG能否减轻高糖致足细胞的凋亡及是否通过内质网应激介导的凋亡途径发挥对足细胞的保护作用。
　　研究方法:
　　细胞分组:①正常糖组（NG:5.6mmol/L葡萄糖）②甘露醇组(M:5.6mmol/L葡萄糖+24.4 mmol/L甘露醇)③高糖组（HG:30mmol/L葡萄糖）④不同浓度的EGCG组（E1:1μmol/L+HG; E10:10μmol/L+HG; E20:20μmol/L+HG; E40:40μmol/L+HG; E60:60μmol/L+HG; E80:80μmol/L+HG;E100:100μmol/L+HG)分别培养24h，48h，72h用CCK8检测细胞增殖情况，根据细胞增殖结果将其分为四组进行后续实验①正常糖组(NG:5.6mmol/L葡萄糖)②甘露醇组（M:5.6mmol/L+24.4 mmol/L甘露醇）⑧高糖组（HG:30mmol/L葡萄糖）④E20组(20μmol/L+HG)培养72h后Western-blotting检测足细胞表面蛋白Nephrin和WT-1的表达，流式细胞技术以及Hoechst染色检测细胞凋亡，Western-blotting检测内质网应激介导的凋亡途径中标志性蛋白分子GRP78、p-PERK、Caspase-12的表达。
　　结果:
　　1.足细胞的增殖:高糖刺激足细胞24h，48h，72h后，足细胞的增殖能力随着时间增加而降低，并且细胞在培养72h后更为明显。EGCG组在高糖环境下能够促进足细胞的增殖，并且EGCG的浓度为20μmol/L培养72h后对促进足细胞的增殖更明显，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　2.足细胞的损伤:各组细胞培养72h后，足细胞表面蛋白分子Nephrin和WT-1在HG组的表达明显的低于NG组和M组(P＜0.05);与HG组相比，E20组足细胞Nephrin和WT-1表达增加(P＜0.05)。
　　3.足细胞的凋亡:流式细胞术显示:HG组足细胞的凋亡率(22.48％)明显高于NG组(0.55％)和M组(0.72％)(P＜0.05)，而E20组细胞的凋亡率(6.57％)明显低于HG组(P＜0.05); Hoechst染色显示:NG组和M组足细胞核形态大小一致、核质均匀，HG组足细胞的细胞核则呈现固缩变小或花瓣状等典型的凋亡形态改变，E20组足细胞细胞核核质均匀凋亡形态的细胞明显减少(P＜0.05)。
　　4.内质网标志性蛋白的表达:与NG组和M组比较，HG组GRP78、p-PERK、Caspase-12蛋白分子表达水平升高(P＜0.05)，与HG组相比，E20组足细胞GRP78，p-PERK，Caspase-12蛋白表达水平降低(P＜0.05)。
　　结论:
　　EGCG可通过抑制内质网应激介导的凋亡途径减轻高糖致足细胞的凋亡作用

目录

声明

摘要

符号说明

前言

1．实验材料

2．实验方法

3．统计学分析

结果

1．EGCG促进足细胞的增殖

2．EGCG能减轻足细胞的损伤

3．EGEG减轻足细胞的凋亡

4．EGCG减轻GRP78、p-PERK和Caspase-12的表达

讨论

结论

附图表

参考文献

综述：内质网应激和肾脏病

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文