槲皮素在博来霉素诱导的大鼠肺纤维化中的治疗作用及机制研究

摘要

研究背景及目的:
　　肺纤维化（pulmonaryfibrosis，PF）是一种重症肺部疾病，是各种不同病因引起的间质性肺病(interstitial lung disease，ILD)病情进展的最终结局。很多原因不明的ILD患者最后确诊与结缔组织病(connective tissue disease，CTD)相关，称为结缔组织病相关间质性肺病(connective tissue disease-associated interstitiallung disease，CTD-ILD)，其中以系统性硬化症发病率最高，可高达60％至70％。而且结缔组织病患者一旦出现了PF，预后极差，可在短期内因重症感染和/或呼吸衰竭死亡。目前糖皮质激素联合免疫抑制剂仍是主要方法，但是该方案副作用明显，不良反应多，且对中后期患者治效果差。因此研究其发病机制及治疗方法尤为重要。
　　现在PF的确切的发病机制尚不清楚，近些年来，氧化应激(oxidative stress)在PF发病中的作用得到越来越多的重视。氧化应激是一种引起分子、细胞和组织损伤的免疫应答，其诱发是因为活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)生成过多和/或抗氧化防御功能下降。研究发现吸入气中氧分压为150mmHg，肺泡中氧分压为100mmHg，而静脉血的氧分压在1至45mmHg之间，这就表明肺一直暴露在高浓度的氧中，因此，相对于其他器官，肺更容易受到氧化应激的损伤。而且联合抗氧化应激治疗如应用N-乙酰半胱氨酸在PF治疗中取得一定的成果。
　　槲皮素(quercetin，QUE)在自然界中非常之多，其中在茶叶、槐花、洋葱、西兰花及柴胡等中含量较高，具有很多生物学活性。近年来，越来越多的专家学者对槲皮素进行了研究，发现其可以直接清除ROS，表现出明显的抗氧化应激作用。而且国外曾试用槲皮素治疗氧化应激相关疾病，取得了良好的效果。因此我们推测其有助于改善肺纤维化的进展。
　　本研究旨在通过构建博来霉素(bleomycin，BLM)诱导的SD大鼠肺纤维化模型，研究槲皮素对肺纤维化治疗及其对氧化应激的作用，同时还研究其对氧化应激相关的MMP-1、TIMP-1、miR-21和TGF-β1/Smad信号通路的影响，以期发现其新的功能，指导其在临床中的应用。
　　方法:
　　将60只体重300g-350g的SD大鼠随机平均分为3组:正常对照组、博来霉素组(BLM group)和博来霉素+槲皮素组（BLM+QUE group），每组20只。BLM组通过向气管内一次性注入BLM5mg/kg构建大鼠肺纤维化模型;正常对照组采取向气管内一次性注入同体积生理盐水;BLM+QUE组采用向气管内一次性注入BLM5mg/kg的当日给予腹腔内注射槲皮素3mg/kg，每日一次，直至大鼠被处死。每组大鼠分别在建模后第12、24及36天随机处死6只。
　　第一部分:槲皮素对博来霉素诱导大鼠肺纤维化的治疗作用
　　1.观察大鼠的一般情况及肺组织的外观，并称重，计算肺系数(lungcoefficient);同时观察大鼠肺组织的HE染色及Masson染色情况，并进行纤维化评分。
　　2.显微镜下观察大鼠支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中的细胞，计算得出细胞总数，并于染色后进行分类计数。
　　3.检测大鼠BALF中的总蛋白含量及肺组织羟脯氨酸(hydroxyproline，HYP)含量。
　　第二部分:槲皮素对肺纤维化大鼠氧化应激的影响
　　检测大鼠肺组织氧化应激标志物丙二醛(malondialdehyde，MDA)的含量;检测肺组织还原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)及氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione，GSSH)的含量，并计算得出还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)比值;同时测定肺组织总抗氧化能力(total anti-oxidative capacity，T-AOC)。
　　第三部分:槲皮素对氧化应激相关细胞因子MMP-1及其抑制剂TIMP-1的影响
　　1.提取肺组织总RNA，逆转录为cDNA后应用实时荧光定量聚合酶链反应(real time polymerase chain reaction，RT-PCR)方法，检测基质金属蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1，MMP-1)和组织型金属蛋白酶抑制剂-1(tissueinhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)的mRNA的表达情况并进行分析。
　　2.应用免疫组化法检测肺组织中MMP-1和TIMP-1蛋白的表达情况并进行分析。
　　第四部分:槲皮素对肺纤维化大鼠miR-21及TGF-β1/Smad信号通路的影响
　　1.将总RNA应用miRNA逆转录试剂盒逆转录为cDNA后应用RT-PCR方法检测miR-21的表达情况。
　　2.应用RT-PCR方法检测转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)和Smad7的mRNA的表达情况并进行分析。
　　3.应用Western blot法检测肺组织中TGF-β1和Smad7蛋白的表达情况并进行分析。
　　统计学分析采用SPSS20.0软件进行，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，两组之间比较应用t检验，多组之间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05被视为差异有统计学意义。
　　结果:
　　第一部分:
　　1.大鼠一般情况:正常对照组不同时间点皮毛光亮，活动好，饮水进食量可，呼吸顺畅，体重稳步上升;BLM组大鼠皮毛无光泽，活动减少，饮水进食减少，呼吸急促，咳喘明显，在第12天即表现出体重明显下降，后期体重虽有所增加，但仍显著少于正常对照组大鼠（12天、24天、36天:P＜0.01），第7天死亡1只;BLM+QUE组大鼠皮毛光泽度一般，活动有所减少，早期饮水进食略减少，有咳喘，后有所缓解，其体重明显高于同时间BLM组(12天、24天、36天:P＜0.01)。
　　2.肺组织情况:正常对照组不同时间点外表红润光滑，质地均匀，富有弹性;BLM组早期肿胀明显，点灶状出血较明显，晚期实变明显，体积明显缩小;BLM+QUE组颜色略偏深，表面少许点状出血，弹性一般。不同时间点BLM组大鼠肺系数较正常对照组明显增高（12天、24天、36天:P＜0.05）;不同时间点BLM+QUE组大鼠肺系数小于BLM组，二者在第36天时有明显差异(P＜0.05)。
　　3.病理学情况:HE染色及Masson染色结果表明，正常对照组不同时间点未发现明显炎症细胞的浸润和胶原纤维的沉积;BLM组大鼠早期即发现明显炎症细胞浸润，少量胶原纤维沉积;后期可见炎症细胞明显减少，肺泡结构破坏明显，肺间质内大量胶原纤维沉积;BLM+QUE组大鼠的早期炎症较轻，炎症细胞较少;后期纤维化程度较轻。不同时间点BLM组大鼠纤维化分数较正常对照组明显升高（12天、24天、36天:P＜0.01）;而不同时间点BLM+QUE组大鼠纤维化分数明显小于BLM组(12天:P＜0.05，24天、36天:P＜0.01)。
　　4.BALF细胞计数及分类计数:正常对照组不同时间点细胞计数及分类计数无明显变化;不同时间点BLM组细胞计数明显高于正常对照组(12天、24天、36天:P＜0.01);不同时间点BLM+QUE组细胞计数明显低于BLM组（12天、24天、36天:P＜0.05）。分类计数发现正常对照组不同时间点中性粒细胞、淋巴细胞及巨噬细胞比例无显著变化;BLM组大鼠与正常对照组相比中性粒细胞比列有增高趋势，在36天后差异有统计学意义(P＜0.05)，淋巴细胞比例有增高趋势，12天后差异有统计学意义（12天、24天、36:P＜0.05），巨噬细胞比例有下降趋势，12天后差异有统计学意义（12天、24天、36天:P＜0.05）;BLM+QUE组大鼠与BLM组相比，中性粒细胞比例有所下降，在36天后差异有统计学意义(P＜0.05)、淋巴细胞比例有所下降，24天后差异有统计学意义（24天、36天:P＜0.05），巨噬细胞比例有所升高，36天后差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　5.BALF总蛋白及大鼠肺组织HYP含量测定:正常对照组不同时间点BALF总蛋白含量无明显变化;BLM组BALF总蛋白第12天明显升高，此后逐步下降，但仍明显高于正常对照组(12天、24天:P＜0.01;36天:P＜0.05); BLM+QUE组BALF总蛋白含量24天后明显低于BLM组（24天、36天P＜0.01）。正常对照组不同时间点肺组织HYP含量无明显变化;BLM组肺组织HYP含量较正常对照组明显增加(12天:P＜0.05，24天、36天:P＜0.01); BLM+QUE组肺组织HYP含量24天后较BLM组明显下降，差异有统计学意义(24天、36天:P＜0.01)。
　　第二部分:
　　1.大鼠肺组织MDA含量测定:正常对照组不同时间点肺组织MDA含量无明显变化;第12天时三组大鼠肺组织MDA含量差异无显著差异;BLM组大鼠24天后MDA含量明显高于正常对照组(24天、36天:P＜0.01);36天后BLM+QUE组大鼠MDA含量明显低于BLM组(P＜0.01)。
　　2.大鼠肺组织GSH/GSSH比值:正常对照组不同时间点肺组织GSH/GSSH无明显变化;BLM组24天后肺组织GSH/GSSH较正常对照组明显降低(24天、36天:P＜0.01); BLM+QUE组24天后肺组织GSH/GSSH明显高于BLM组(24天、36天:P＜0.01)。
　　3.大鼠肺组织T-AOC测定:正常对照组不同时间点肺组织T-AOC无明显变化;BLM组肺组织24天后T-AOC显著低于正常对照组(24天:P＜0.05，36天:P＜0.01); BLM+QUE组24天后肺组织T-AOC较BLM组大鼠明显增加（24天、36天:P＜0.05）。
　　第三部分:
　　1.RT-PCR检测MMP-1和TIMP-1的mRNA表达:正常对照组不同时间点MMP-1和TIMP-1的mRNA表达无明显变化;与正常对照组相比， BLM组MMP-1和TIMP-1的mRNA均显著增加（12天、24天、36天MMP-1:P＜0.01;12天TIMP-1:P＜0.05，24天、36天TIMP-1:P＜0.01）;与BLM组相比，BLM+QUE组MMP-1和TIMP-1的mRNA水平明显下降，均在24天后表现为显著性差异（24天、36天MMP-1: P＜0.05;24天TIMP-1:P＜0.05，36天TIMP-1:P＜0.01）。
　　2.免疫组化测定MMP-1和TIMP-1蛋白表达:正常对照组不同时间点MMP-1及TIMP-1蛋白表达变化不明显;与正常对照组相比，BLM组MMP-1及TIMP-1蛋白表达明显增加（12天、24天、36天MMP-1: P＜0.01;12天、24天TIMP-1:P＜0.05，36天TIMP-1:P＜0.01）;不同时间点BLM+QUE组大鼠MMP-1及TIMP-1蛋白表达均低于BLM组，MMP-1在24天后表现为显著性差异（24天:P＜0.01，36天:P＜0.05），TIMP-1在36天后表现为统计学差异(P＜0.05)。
　　第四部分:
　　1.RT-PCR检测miR-21表达:正常对照组不同时间点miR-21表达无明显变化;与正常对照组相比，BLM组miR-21水平显著增加（12天:P＜0.05、24天、36天:P＜0.01）;与BLM组相比，BLM+QUE组miR-21水平比明显下降，24天后表现出统计学意义（24天:P＜0.05，36天:P＜0.01）。
　　2.RT-PCR检测TGF-β1和Smad7的mRNA表达:正常对照组不同时间点TGF-β1和Smad7的mRNA表达无明显变化;与正常对照组相比，BLM组TGF-β1mRNA显著增加（12天、24天、36天:P＜0.01），Smad7 mRNA显著减少(12天:P＜0.05，24天、36天:P＜0.01);与BLM组相比，BLM+QUE组TGF-β1 mRNA水平比明显下降（12天、24天、36天:P＜0.01），Smad7 mRNA水平明显升高，24天后表现出统计学差异（24天、36天:P＜0.05）。
　　3.Western blot法检测TGF-β1和Smad7蛋白的表达:正常对照组不同时间点TGF-β1和Smad7蛋白表达变化不明显;与正常对照组相比，BLM组TGF-β1显著增加（12天、24天、36天:P＜0.01），Smad7显著减少，24天后有统计学意义（24天、36天:P＜0.05）;与BLM组相比，BLM+QUE组TGF-β1水平比明显下降（12天、24天、36天:P＜0.01），Smad7水平明显升高，24天后表现出统计学差异（24天、36天:P＜0.05）。
　　结论:
　　1.通过经气管注入博来霉素的方法可以成功构建大鼠肺纤维化模型，用于肺纤维化的实验研究。
　　2.槲皮素能够改善肺纤维化大鼠的总体状况，减轻其炎性损伤和减少胶原蛋白沉积。
　　3.槲皮素不但可以抑制肺组织ROS生成，而且还增强肺组织的抗氧化能力，表明其能够抑制氧化应激减轻肺纤维化。
　　4.槲皮素能够抑制MMP-1、TIMP-1的表达，部分恢复MMPs/TIMPs失衡状态，减少胶原沉积，促进细胞外基质降解，改善肺纤维化。
　　5.槲皮素能够抑制TGF-β1、miR-21的表达，增强Smad7的活性，通过干预TGF-β1/Smad信号通路减轻肺纤维化。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分：槲皮素对博来霉素诱导大鼠肺纤维化的治疗作用

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

第二部分：槲皮素对肺纤维化大鼠氧化应激的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

第三部分：槲皮素对氧化应激相关细胞因子MMP-1及其抑制剂TIMP-1的影响

材料与方法

结果

讨论

结论

第四部分：槲皮索对肺纤维化大鼠miR-21及TGF-β1／Smad通路的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

创新点和局限性

附表

附图

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文

学位论文评阅及答辩情况表

English paper 1：Therapeutic effects of quercetin on bleomycin induced pulmonary fibrosis in rats

English paper 2：Therapeutic and Diagnostic Progress of Rheumatoid Arthritis-associated Interstitial Lung Disease