羟基磷灰石纳米带/聚乳酸骨诱导-屏障“双面神”复合膜对牙周骨组织再生的作用研究

摘要

目的:
　　牙周炎是导致牙齿丧失、牙槽骨吸收并最终导致咀嚼功能紊乱的炎症性疾病。引导组织再生术(guided tissue regeneration，GTR)是牙周再生医学领域最重要的技术手段之一。羟基磷灰石（hydroxyapatite，HAp）和聚乳酸是(polylactic acid，PLA)是美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准的可用于临床治疗的生物材料，前者可促进骨组织再生，后者则是临床常见的屏障膜材料。通常在手术过程中，屏障膜及骨引导或骨诱导材料被分别放置于创伤区域，这将增加感染和术中出血的几率，同时也会增加手术难度。为解决这一问题，以罗马神话中双面神雅努斯(Janus)为灵感，设计了一种新型的HAp纳米带改良的PLA“双面神”复合膜，以期达到骨诱导/屏障双重作用。亲水的HAp面可诱导骨组织再生，疏水的PLA面可起到屏障保护作用，防止骨再生过程中牙龈等纤维结缔组织长入创区。本实验的目的是通过制备新型HAp/PLA“双面神”复合膜，检测其表面形貌及理化特征，并通过建立大鼠下颌骨牙周缺损模型研究该复合膜对牙周骨组织的诱导再生作用。
　　方法:
　　(1)HAp/PLA“双面神”复合膜的制备及性质表征。通过蒸发渗透自成膜法制备HAp/PLA“双面神”复合膜。使用扫描电镜(scanning electron microscope，SEM)观察HAp纳米带及PLA膜的形貌及纳米带长度，高分辨率透射电子显微镜（high-resolution transmission electron microscope，HRTEM）及透射电子显微镜(transmission electron microscope，TEM)观察纳米带形貌、宽度、厚度及晶格特征，红外光谱（fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）对HAp纳米带及PLA膜进行定性分析，利用X射线衍射物相分析(X-ray diffraction，XRD)对HAp纳米带及PLA膜进行X射线衍射分析获取物相分析结果，SEM下观察复合膜断面。
　　(2)动物实验分为三组，分别为空白对照组(negativecontrol，NC)，单纯PLA膜材料组(PLA)，HAp/PLA复合膜组(HAp/PLA)。在8周龄的雄性Wistar大鼠的下颌骨两侧分别制备5mm×4mm×1mm的牙周骨缺损模型，分别将上述膜材料覆盖于缺损表面，并设置空白对照组。于术后3天、1、2、4、8周处死实验动物并取材。
　　(3)术后3天、1、2、4、8周，通过hematoxylin&eosin(H&E)染色，micro-computed tomography(Micro CT)扫描分析比较三组骨缺损的愈合情况。
　　(4)术后8周，大体组织下观察比较三组创区组织黏连情况。
　　(5)术后8周，取出PLA、HAp/PLA组的屏障膜，SEM下观察比较创区面功能性细胞募集情况。
　　(6)术后3天、1、2、4、8周，免疫组化（immunohistochemistry，IHC）检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、骨钙素(osteocalcin，OCN)、Ⅰ型胶原(collagenⅠ，ColⅠ)的表达情况，从而检测功能性细胞成骨分化的情况。所得数据以均数±标准差（X±S）表示。使用SPSS20.0统计分析软件包，对相关参数进行单因素方差分析，P＜0.05时有统计学意义。
　　结果:
　　(1)成功构建出HAp/PLA“双面神”复合膜，SEM显示HAp面比较粗糙，HAp纳米带长约20-30μm，PLA面显示出多孔性并且孔壁表面十分光滑。HRTEM显示HAp纳米带的栅距为(001)(～0.344nm)，与典型羟基磷灰石一致。HRTEM及TEM显示HAp纳米带的宽度大约为15nm。FTIR显示HAp纳米带在3752cm-1(-OH)和1029cm-1(PO43-)处拥有羟基磷灰石的固有峰，PLA面拥有典型官能团。XRD显示HAp纳米带所有的峰都与标准羟基磷灰石的固有峰一致，PLA面为外消旋非晶型结构。同时，通过SEM在复合膜HAp纳米带及PLA之间发现了过渡层的存在。复合后，HAp一面显示出良好的亲水性;PLA一面显示出优良疏水性。
　　(2)术后大鼠成活率90％，缺损处未出现明显炎症反应及免疫排斥反应。
　　(3)术后3天，组织学H&E染色及Micro CT显示三组缺损处骨组织愈合情况无明显差异;1、2、4、8周后，HAp/PLA组骨组织愈合情况均明显优于NC组及PLA组，新生骨量明显多于后两组(P＜0.05)，NC组及PLA组骨愈合情况无明显差异。
　　(4)术后8周，大体解剖观察，PLA组及HAp/PLA组均无明显纤维组织黏连情况存在，NC组则存在明显纤维组织黏连情况。
　　(5)术后8周，SEM显示HAp/PLA“双面神”复合膜创区面有大量功能性细胞附着，且可观察到矿化的基质样沉积物;PLA面基本没有功能性细胞附着。
　　(6)术后3天，三组免疫组化结果均无明显差异。ALP免疫组化染色显示1周时，HAp/PLA组的平均光密度(meanoptical density，MOD)值明显高于其余两组(P＜0.01)，随后数值开始下降，但仍高于后两组，8周时基本消失，空白对照组及PLA组始终无明显差异。OCN免疫组化显示OCN表达量逐渐增多，1、2、4周时HAp/PLA组MOD值稍高于其余两组，8周时明显高于后两组(P＜0.05)，空白对照组及PLA组均无明显差异。ColⅠ免疫组化染色显示ColⅠ随时间表达逐渐升高，其中HAp/PLA组始终高于其余两组，4周及8周时差异尤为明显(P＜0.05)，空白对照组及PLA组无明显差异。
　　结论:
　　HAp/PLA“双面神”复合膜PLA面疏水且光滑，可以有效阻止骨缺损愈合过程中纤维结缔组织长入创区。HAp面亲水且粗糙，可募集大量功能性细胞并促进其成骨分化及成骨相关蛋白的表达，促进新骨形成同时提高新骨质量，有效促进牙周缺损处的骨修复及骨再生。与单纯PLA屏障膜相比，HAp/PLA“双面神”复合膜不仅可以发挥屏障保护作用，而且具有募集功能性细胞及促进骨缺损再生的作用，从而实现一张膜两个功能面的目标，有效减少感染和创区出血的发生几率，提高手术效率及手术成功率。

目录

声明

摘要

英文缩写对照表

前言

一、试验材料与设备

二、实验步骤和方法

实验结果

1．HAp纳米带、单纯PLA膜制备及性质表征

2．HAp／PLA“双面神”复合膜性质表征

3．HAp／PLA“双面神”复合膜及单纯PLA屏障膜功能性细胞募集情况

4．HAp／PLA“双面神”复合膜诱导成骨情况

5．下颌骨标本Micro CT扫描及新骨形成情况评估

讨论

全文总结

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的文章