蛋白酶体抑制剂通过促进AGR2泛素化降解并增强贝伐珠单抗的抗肿瘤作用研究

摘要

研究目的：
　　本论文在前期研究的基础上进一步分析:i）AGR2是否能进行泛素化介导的降解途径，其Lys是否参与其降解过程;ii)蛋白酶体抑制剂通过下调AGR2、降低AGR2的促血管新生作用，是否能增加血管新生靶向药物贝伐珠单克隆抗体(bevacizumab，Bev)的药效。
　　研究方法与结果:
　　1.蛋白酶体抑制剂下调AGR2的表达并促进其蛋白的泛素化
　　本课题组的前期结果发现，蛋白酶体抑制剂MG132可显著下调AGR2的表达、并通过诱导自噬促进AGR2的降解。我们首先利用另一种蛋白酶体抑制剂硼替佐米(Bortezomib，Bor)进一步确定此作用。Western blotting结果显示，BOR可显著降低AGR2的表达，而蛋白酶体的底物p53和p27的表达却呈增加趋势。同时，免疫共沉淀结果表明，蛋白酶体抑制剂可以增加AGR2蛋白的多泛素化水平。因此，抑制蛋白酶体活性可促进AGR2的泛素化降解。
　　2.E3连接酶UBR5介导AGR2与泛素K48位点的连接
　　(1) MG132可以通过K48泛素链介导AGR2多泛素化降解
　　由于泛素主要通过K48、K63对底物进行泛素化修饰而促进底物的降解。我们在293T细胞中转染只含泛素K48、K63以及K48突变质粒K48R、K63突变质粒K63R，通过免疫共沉淀实验确定AGR2的多泛素化链的形成位点。结果显示，在抑制剂MG132作用下，非常显著的促进泛素K48介导AGR2的多泛素化，而当K48突变时(K48R)，AGR2的泛素化显著降低。并通过Western blotting实验证实，过表达泛素K48，自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamycin，RAPA)显著降低AGR2的水平，当K48突变时，下调AGR2的作用明显减弱;而自噬抑制剂氯喹(Chloroquine，CQ)显著恢复AGR2的蛋白水平、降低K48对AGR2的降解作用。因此，MG132通过K48泛素链介导的AGR2多泛素化降解。
　　(2) MG132通过E3连接酶UBR5介导AGR2的泛素化
　　为了确定介导AGR2泛素化的E3连接酶，我们前期通过IPA软件，利用TCGA数据库分析AGR2的相互作用蛋白，发现Ubiquitin protein ligase E3component-recognin5(UBR5)蛋白能够与AGR2相互作用，我们推测UBR5是否发挥E3连接酶作用，催化其底物AGR2的泛素化。Western blotting结果显示，在MG132作用下，过表达UBR5可以明显下调AGR2的蛋白水平;而当UBR5泛素化功能域突变后(UBR5-C2768A)，MG132抑制AGR2的作用显著降低，表明UBR5介导AGR2泛素化降解。免疫共沉淀结果表明，AGR2能结合UBR5、在其蛋白沉淀复合物中出现明显条带，而不能与泛素化位点突变的UBR5产生蛋白间的相互作用，进一步证实，E3连接酶UBR5介导AGR2的泛素化降解。
　　3.蛋白酶体抑制剂通过AGR2-Lys89位点促进其泛素化降解
　　赖氨酸(Lys，K)是蛋白发生泛素化的关键氨基酸，而AGR2蛋白含17个赖氨酸，为了确定AGR2发生泛素化的关键赖氨酸，我们前期构建了AGR2中Lys全部突变的表达质粒(Km)，以及K26、K30、K31、K34、K39、K64、K66、K70、K88、K89、K95、K99、K116、K165、K166、K169、K172位点突变为精氨酸R的相应表达质粒。Western blotting结果显示，当K34、K66、K89、K169这四个赖氨酸残基突变为R时，能减弱MG132下调AGR2的作用，而其他位点的Lys突变时作用并不显著，表明K34、K66、K89、K169可能参与AGR2与泛素的连接。随后我们又构建了只含34、66、89和169位赖氨酸的AGR2突变质粒，进一步分析介导AGR2泛素化的关键氨基酸残基。免疫共沉淀结果表明，当K89位点赖氨酸存在的情况下，MG132能够显著增加AGR2的泛素化，K89突变后，AGR2的泛素化水平显著降低。而34、66和169的赖氨酸存在时并不显著增加AGR2的泛素化。因此，第89位Lys是介导AGR2泛素化的关键氨基酸。
　　4.蛋白酶体抑制剂通过自噬受体NBR1和p62介导AGR2的泛素化降解
　　前期结果证实，MG132通过诱导自噬促进AGR2的降解。由于泛素化目标蛋白需要被特定的自噬受体识别进而被自噬溶酶体识别降解。我们首先检测通用自噬受体SQSTM1/p62的变化，结果发现MG132处理后SQSTMl/p62并无降低，而是略有升高，免疫共沉淀结果显示，AGR2并不结合SQSTM1/p62。进一步分析其他介导AGR2降解的自噬受体。实验结果显示，在MG132作用下，自噬受体Calcium binding and coiled-coil domain2(NDP52)和Optineurin(OPTN)不与AGR2形成复合物，而Neighbor of BRCA1 gene1(NBR1)非常显著的与AGR2结合，表明NBR1是MG132诱导AGR2泛素化降解的自噬受体。
　　我们随后确定硼替佐米(Bor)是否具有相同的作用，结果发现，Bor不同于MG132，可同时下调SQSTM1/p62和NBR1的表达水平。免疫共沉淀结果证实，在Bor的作用下，SQSTM1/p62也与AGR2形成沉淀复合物，出现明显条带。因此，蛋白酶体抑制剂MG132和Bor通过NBR1和SQSTM1/p62介导泛素化AGR2的降解。
　　5.蛋白酶体抑制剂下调AGR2能够增强贝伐珠单抗的抗肿瘤药效
　　我们前期结果显示，高表达的AGR2会增加分泌AGR2的水平，分别通过上皮间质转换，以及和VEGF形成复合物促进肿瘤侵袭转移、阻断血管新生靶向药物贝伐珠单抗的活性。所以我们推测，在AGR2高表达的情况下，蛋白酶体抑制剂下调AGR2的作用是否能增加肿瘤对贝伐珠单抗的敏感性。
　　(1) Bor和贝伐珠单抗联用具有协同增效作用
　　药物联用曲线显示，Bor和贝伐珠单抗联用，其CI值小于0.3，具有很好的协同增效作用。我们又通过动物实验进行验证。通常Bor的用药剂量是1.2mg/kg，考虑到其毒性，我们采用0.8mg/kg(标注高剂量组Bor-H)和低剂量Bor(0.2mg/kg，Bor-L)组。结果显示，高剂量组具有良好的药效，小鼠的瘤重、瘤体积显著减少，而低剂量Bor组的药效较高剂量组有所降低。贝伐珠单抗组的药效也无显著优势，但是联用低剂量Bor后，小鼠瘤重和瘤体积都非常显著的降低，呈现出很好的协同效应。HE染色结果显示，联合用药组ki67和CD31的水平都极大降低，进一步证实联用的协同药效。
　　(2) Bor和贝伐珠单抗联用诱导自噬、下调AGR2
　　分子水平检测结果表明，Bor-H、Bor-L和联合用药组都出现明显的凋亡指标，即PARP出现显著的剪切带，贝伐珠单抗组无明显条带，与其药效结果一致。Bor-H和联合用药组对LC3-II的诱导作用较Bor-L组更为显著，同样，贝伐珠单抗组对自噬无显著影响。Bor组都显著降低NBR1和SQSTM1/p62的水平，联合用药组中SQSTM1/p62的下调更为突出，而贝伐珠单抗组对NBR1和SQSTM1/p62无显著影响。最为重要的是，Bor-H和Bor-L都显著降低AGR2水平，贝伐珠单抗组不影响AGR2的表达，但联用Bor-L后AGR2的水平显著降低。因此，低剂量的Bor联用贝伐珠单抗显示出很好的自噬诱导作用、并下调AGR2的蛋白水平。
　　(3) Bor和贝伐珠单抗联用显著降低毒性，提高小鼠生存质量
　　我们采用常规指标以及动物行为学实验方法测定药物的毒性。结果发现，Bor-H组具有显著降低小鼠体重、产生较高的肝功ALT、AST指标并影响小鼠的运动能力的现象，这体现出高剂量Bor确实会对机体产生一定的药物毒性，而Bor-L、Bev、Bor-L+Bev联用组并不会显著降低小鼠体重，不影响小鼠的摄食能力，且在肝功ALT、AST指标和小鼠运动能力和运动轨迹指标上与对照组有着近似的表现，特别是联用组在提供显著抗肿瘤药效的情况下，依旧能够保持对机体较小的药物影响，保证小鼠的生存质量。因此，低剂量Bor联用贝伐珠单抗具有提高药效、降低毒性的作用，其中Bor下调AGR2的作用是其发挥协同效应的重要机制，为临床的药物联合治疗提供了实验依据。
　　研究结论:
　　1.蛋白酶体抑制剂促进内质网蛋白AGR2的泛素化，并通过自噬降解途径下调AGR2的蛋白水平。
　　2.UBR5是AGR2进行泛素化的E3连接酶。
　　3.AGR2泛素化降解的过程中，其89位赖氨酸是泛素化的关键氨基酸，并以泛素K48位点的连接方式实现AGR2的多泛素化。
　　4.蛋白酶体抑制剂MG132和硼替佐米通过NBR1和SQSTM1/p62识别泛素化AGR2，并促进其自噬降解。
　　5.蛋白酶体抑制剂下调AGR2的作用能够减少AGR2的促血管新生作用，增强血管新生靶向药物贝伐珠单抗的抗肿瘤活性，低剂量Bor和贝伐珠单抗联合用药产生很好的协同增效、减毒效果。。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

一、二硫键异构酶AGR2在肿瘤中高表达

二、AGR2是潜在的治疗靶标

三、AGR2的表达影响药物疗效

四．泛素—蛋白酶体降解途径(ubiquitin-proteasome pathway)

五．自噬—溶酶体降解途径(autophagy-lysosome pathway)

1 实验材料

2 实验方法

实验结果

2．E3连接酶UBR5介导AGR2与泛素K48位点的连接

3．蛋白酶体抑制剂通过AGR2-Lys89位点促进其泛素化降解

4．蛋白酶体抑制剂通过自噬受体NBR1和p62介导AGR2的泛素化降解

5．蛋白酶体抑制剂下调AGR2能够增强贝伐珠单抗的抗肿瘤药效

6．Bor和贝伐珠单抗联用显著降低毒性，提高小鼠生存质量

讨论

参考文献

致谢

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