鼻咽癌的miRNA组学动态表达特征及miR-18a通过Dicer1介导的致癌机制研究

摘要

MicroRNAs（miRNAs，小非编码RNA）能够与下游靶基因mRNA的3'UTR碱基配对并引导沉默复合物（RISC）降解mRNA或抑制mRNA的翻译，参与生物合成和肿瘤的发展，其生物学功能机制是目前研究的热点领域之一。miRNA组学（microRNomics）属于基因组学的分支，包括miRNAs差异筛选、动态表达、分子结构、表达调控、靶基因预测及生物学功能分析等研究。鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)发生、发展及转移是一个多步骤多因素参与的复杂过程。迄今为止，对鼻咽癌组织进行miRNA分子差异表达谱分析的研究也是十分有限。在本论文中，我们旨在阐明鼻咽癌不同临床阶段的miRNA组学时空变化趋势以及miR-18a调控miRNAs组学作用的研究机制。
　　 [鼻咽癌不同临床阶段miRNA组学动态表达规律]
　　 利用显微切割分离纯化不同临床阶段的鼻咽癌组织标本和对照鼻咽上皮标本，采用illumina的miRNA芯片分析，MultiClassDif统计软件筛选出48个miRNAs分子在鼻咽癌不同临床阶段组学中表达存在差异。进一步运用生物学软件cluster3.0软件，将差异miRNA组的表达分为6种动态模式:其中3类差异miRNA组的模式归纳为不同的下降模式;另外3类差异miRNA组是不同的上升模式。进而运用targetScan软件，分析并预测差异miRNAs组靶基因，用数据库ftp://ftp.ncbi.nih.gov/repository/UniGene/组织特异性筛选差异miRNA组靶基因。然后与NCBI中鼻咽癌cDNA数据库(GEO:GSE12452)数据整合，得到以Smad2等为代表的差异miRNAs组的靶基因，并通过real-time PCR验证部分miRNAs和靶基因在不同临床分期的鼻咽癌组织标本和对照样本中的表达。通过GO和pathway分析，上调差异miRNAs组的靶基因GO功能主要集中在粘附、凋亡和细胞死亡;下调差异miRNAs组的靶基因GO功能主要集中在细胞增殖、死亡和凋亡;上调差异miRNAs组的靶基因pathway主要集中在Adherens junction、Focal adhesion等与肿瘤转移相关的pathway，而下调差异miRNAs组的靶基因pathway主要集中在Pathways in cancer等。利用miRNAs与靶基因的负相关性，绘制了差异miRNAs组与靶基因的miRNAs-Genes网络图。miRNAs调控除了直接受Dicer1和Drosha的作用外，还受到转录因子的调控，因此，我们利用UCSC寻找差异miRNAs编码基因在基因组上的位置，确定ETS2等转录因子在调控miRNAs编码基因表达发挥循环反馈调控作用;并绘制差异miRNAs和转录因子的调控网络关系。为鼻咽癌发生、发展的分子机制研究提供新的思路。
　　 [MiR-18a具有促进鼻咽癌增殖、迁移和侵袭转移功能]
　　 MiRNA芯片筛选发现miR-18a在鼻咽癌不同临床分期及淋巴结转移癌中存在显著差异。利用real-time PCR证实miR-18a随着临床分期进展而表达逐渐增加，并且在鼻咽癌细胞中高表达，原位杂交结果显示miR-18a与鼻咽癌的临床分期、淋巴结转移、EBV感染以及预后相关。MTT、伤口愈合实验以及transwell基质胶侵袭实验证明miR-18a过表达分别能够促进鼻咽癌细胞HK1、5-8F和6-10B的增殖、迁移能力和侵袭转移能力;反之抑制miR-18a则减少或降低鼻咽癌细胞的增殖、迁移能力和侵袭转移能力。采用慢病毒系统构建m iR-18a的过表达和knockdown的稳定鼻咽癌HK1细胞系并通过real-time PCR验证。采用活体荧光示踪技术模拟miR-18a在裸鼠体内的促进鼻咽癌增殖和转移模型，揭示m iR-18a能够促进裸鼠体内皮下移植瘤的增殖，miR-18a能够促进鼻咽癌细胞在裸鼠体内转移能力。
　　 [MiR-18a通过Dicer1促进鼻咽癌发展的致癌机制]
　　 通过targetScan等软件预测、以及荧光素酶报告基因实验证明Dicer1是miR-18a的靶基因，并采用real-time和western验证miR-18a能降低内源性Dicer1的表达。通过miRNA芯片检测发现miR-18a能够下调78％的其他miRNA表达，恢复Dicer1则逆转80％的 miRNA的表达。其中miR-18a下调miR-143和miR-200家族表达最为显著。通过miR-18a处理Dicer1的过表达和knockdown的细胞，从正反两面证实miR-18a作为一个癌基因通过Dicer1发挥生物学功能。real-time PCR和western验证miR-18a可以调控miR-200家族及EMT标志物分子的变化;另外验证miR-18a通过Dicer1调控miR-143及靶基因K-Ras的表达，促进鼻咽癌的发展。
　　 综上所述，我们通过miRNA芯片筛选到一组与不同临床分期发展及淋巴转移可能起关键作用的miRNAs，揭示了鼻咽癌不同临床阶段的差异miRNAs组学变化趋势，通过与网络GEO数据整合，阐述了鼻咽癌差异miRNAs的靶基因的GO和pathway分析，进一步分析差异miRNAs表达调控的因素，利用UCSC数据寻找调控差异miRNAs组学的转录因子以及他们之间的反馈调控关系。阐述了miR-18a能够促进鼻咽癌细胞的增殖，侵袭转移功能及促进裸鼠体内的成瘤速度和转移转移能力。揭示miR-18a通过Dicer1调节miRNAs组学的表达，通过生物学功能实验证明miR-18a通过Dicer1促进鼻咽癌的发生发展。阐述了miR-18a与miR-200家族和miR-143以及其他miRNAs之间的关系，揭示了miR-18a与Dicer1在鼻咽癌的临床分期、淋巴结转移、EBV感染以及预后的相关性。

目录

声明

摘要

主要缩略词简表

第一章 前言

第二章 材料与方法

1．材料

1．1 组织和细胞系样本

1．2 实验动物

1．3 菌株和质粒载体

1．4 Human MicroRNA芯片

1．5 试剂

1．6 引物

1．7 主要仪器

2 方法

2．1 鼻咽癌标本及对照标本采集

2．2 显微切割纯化鼻咽癌组织标本

2．3 RNA的提取

2．4 miRNA芯片

2．5 miRNA芯片数据分析

2．6 实时定量PCR(Real-time PCR)验证

2．7 miRNA瞬时转染目的细胞

2．8 质粒构建及细菌克隆

2．9 细胞生物学实验

2．10 免疫组化、免疫荧光检测和原位杂交检测

2．11 Luciferrase检测miRNA靶基因

2．12 Western Blot

2．13 裸鼠动物试验

2．14 统计学分析

第三章 结果

第一部分：鼻咽癌不同临床阶段miRNA组学动态表达规律

1．1 鼻咽癌组织标本和对照上皮组织的收羹

1．2 鼻咽癌组织标本显微切割

1．3 鼻咽癌不同临床分期及转移淋巴癌的miRNA芯片筛选

1．4 鼻咽癌差异miRNA演进的动态表达模式

1．5 差异miRNA的靶基因筛选

1．6 差异miRNA的靶基因的GO及pathway分析

1．7 差异表达miRNAs与靶基因的miRNA-Genes调控网络

1．8 差异miRNA的表达调控因素分析

第二部分：miR-18a生物学功能研究

2．1 鼻咽癌miRNA芯片中大部分miRNA下调趋势

2．2 miR-18a在不同阶段的鼻咽癌中的表达以及与临床预后的相关性

2．3 miR-18a促进鼻咽细胞的增殖、侵袭以及转移能力

2．4 miR-18a过表达和knockdown的稳定细胞株构建

2．5 miR-18a促进动物体内鼻咽癌的细胞的增殖和转移

第三部分：miR-18a通过Dicer1介导的鼻咽癌的致病机制

3．1 miR-18a靶向调节Dicer1的表达

3．2 miR-18a通过Dicer1调节miRNA的表达合成

3．3 miR-18a通过Dicer1影响其生物学效应

3．4 miR-18a与Dicer1表达的相关性分析

第四章 讨论

结论

参考文献

综述

致谢

研究成果