VEGF165、BMP4基因复合生物活性玻璃组织工程骨的构建及修复骨缺损的研究

摘要

背景:
　　骨缺损的治疗至今仍是骨科临床上的一个难题。目前最好的治疗方法依然是自体骨的移植，但是自体骨来源比较有限，而且自体骨取材会给患者带来一定的痛苦及并发症，极大的限制了其临床应用。近年来，骨组织工程发展迅速，骨组织工程对骨缺损的治疗成为研究和临床应用的一个热点领域。组织工程骨诱导新生骨的形成和血管化问题已成为制约其临床应用的关键因素。骨形态发生蛋白(BMP)的新骨形成作用已被广泛认可，血管内皮生长因子(VEGF)是最为重要的促新生血管形成细胞因子。有研究发现，在骨缺损或骨损伤的修复过程中，BMP和VEGF都有大量的表达上调，并相互协同，共同修复缺损的骨组织。VEGF基因和BMP基因的联合应用，可以实现新生骨形成和骨血管化的双重重建，是完善骨缺损修复的一个合理的研究思路和方法。利用缺陷型单纯疱疹病毒载体携带外源性的BMP及VEGF基因进入组织工程骨的种子细胞中，并使其与支架材料进行复合，组建BMP和VEGF双基因修饰的组织工程骨是目前国际上对骨缺损研究的一个热点。缺陷型单纯疱疹病毒载体具有安全、高效、稳定表达各生长因子基因的优点，目前开始应用于基因药物的研发中。
　　目的:
　　(1)构建rdHSV-1-VEGF165-BMP4骨缺损修复载体，并使其在种子细胞MSCs中大量共表达。
　　(2)观察rdHSV-1-VEGF165-BMP4与生物活性玻璃(BG)复合后骨胶原蛋白、骨钙素、碱性磷酸酶活性等指标，鉴定组织工程骨的体外成骨能力。
　　(3)验证rdHSV-1-VEGF165-BMP4复合BG材料的组织工程骨在修复骨缺损模型中的治疗效果。
　　材料和方法:
　　(1)取人骨肉瘤成骨样细胞(MG-63)，并进行裂解处理，克隆出人BMP4基因及VEGF165基因;对单纯疱疹病毒HSV1进行改造，组建缺陷型单纯疱疹病毒载体系统;将调取的BMP4及VEGF165基因通过穿梭质粒载入单纯疱疹病毒载体，构建rdHSV-1-VEGF165-BMP4病毒载体。
　　(2)日本大耳白兔的骨髓间质干细胞(MSCs)的分离、培养和体外增殖。
　　(3)前3部分的实验分为两组:rdHSV-1-VEGF165-BMP4实验组（或rdHSV-1-VEGF165-BMP4与BG复合组织工程骨）和对照组，分别感染MSCs细胞;第4部分分为4组:rdHSV-1-VEGF165-BMP4复合BG组（VEGF165-BMP4组）、单纯生物玻璃组（BG组）、自体骨髓移植组（AB组）及对照组（CON组），分别植入建立的兔桡骨缺损部位。
　　(4)感染rdHSV-1-VEGF165-BMP4病毒后48小时，通过间接免疫荧光、蛋白免疫印迹反应、免疫组织化学、酶联免疫吸附实验等方法检测各组VEGF165及BMP4基因的表达情况。
　　(5)感染rdHSV-1-VEGF165-BMP4两周后，对VEGF165-BMP4实验组及对照组CON进行碱性磷酸酶活性含量的检测，骨胶原蛋白、骨钙素的检测以鉴定其成骨能力。
　　(6)将感染rdHSV-1-VEGF165-BMP4病毒的MSCs细胞与生物玻璃材料进行复合，并于复合后2周观察碱性磷酸酶活性、胶原蛋白及骨钙素的表达情况。
　　(7)构建兔桡骨骨缺损模型，并将组织工程骨复合物植入骨缺损部位，并于植入后4、8、12周用X线、免疫组织化学、骨密度检测等观察体内成骨情况。
　　结果:
　　(1)成功构建了rdHSV-1-VEGF165-BMP4病毒载体系统。
　　(2)感染MSCs细胞后，VEGF165及BMP4基因的mRNA转录水平及蛋白表达水平显著高于对照组。
　　(3)感染MSCs细胞后，VEGF165-BMP4组细胞中碱性磷酸酶活性含量、骨胶原蛋白、骨钙素显著高于CON组的水平。
　　(4)感染rdHSV-1-VEGF165-BMP4病毒的MSCs细胞与生物玻璃材料进行复合后，其碱性磷酸酶活性含量、骨胶原蛋白、骨钙素表达显著高于CON组的水平。
　　(5)骨缺损模型修复实验中X线结果显示，VEGF165-BMP4组及AB组植入后4周，已有骨痂形成，植入后8周已有大量骨痂、骨小梁及皮质骨形成，而在BG组和CON组形成很少。植入后12周，VEGF165-BMP4组及AB组形成了完整的板层骨，骨髓腔完全贯通，骨缺损完全修复，而BG组合CON组骨缺损处主要被结缔组织填充。
　　(6)骨缺损模型修复实验中组织学检测结果显示，VEGF165-BMP4组成骨细胞活跃，可见大量骨母细胞;VEGF165-BMP4组合AB组形成的骨小梁及编制骨都多于BG组及CON组。组织学评分显示，VEGF165-BMP4组骨痂的生成量显著多于BG组及CON组(P＜0.01)。
　　(7)生物力学检测显示，术后的第4、8、12周时VEGF165-BMP4组的最大抗折载荷均高于BG组和CON组(P＜0.01)，但VEGF165-BMP4组与AB组无显著差异(P＜0.01)。
　　(8)骨密度检测显示，VEGF165-BMP4组和AB组的骨密度值间无差异，但二者的骨密度均显著的高于BG组合CON组(P＜0.01)。
　　结论:
　　利用缺陷型单纯疱疹病毒载体系统进行VEGF及BMP基因感染的兔MSCs细胞复合生物玻璃(BG)构建的组织工程骨，在体外水平上可以使MSCs细胞安全、高效、稳定的表达VEGF165及BMP4基因;具有显著的体外成骨作用。建立的组织工程骨在体内可以促进成骨和血管化作用，对缺损的兔桡骨具有良好的骨传导性及骨诱导性，对骨缺损的修复效果显著优于单纯BG材料，且与自体骨移植效果相似。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

实验一 rdHSV-1-VEGF165-BMP4骨缺损修复载体构建

前言

1 实验材料和方法

1．1 主要仪器

1．2 主要试剂

1．3 细胞株

1．4 VEGF165、BMP4基因的克隆

1．5 VEGF165及BMP4基因病毒表达载体的构建

1．6 HSV-1-VEGF165-BMP4病毒载体滴度的测定

1．7 病毒载体VEGF及BMP4的Western blotting鉴定

2 实验结果

2．1 总RNA浓度

2．2 VEGF、BMP4基因及载体鉴定结果

2．3 复制缺陷型病毒载体VEGF、BMP4表达鉴定

2．4 病毒滴度

3 讨论

4 结论

实验二 HSV-1-VEGF165-BMP4转染MSCs细胞及其表达的鉴定

前言

1 实验材料和方法

1．1 实验试剂

1．2 主要仪器

1．3 实验动物

1．4 实验试剂配制

1．5 兔骨髓间质干细胞(MSCs)的体外分离及培养

1．6 HSV-1-VEGF165-BMP4感染MSCs细胞

1．7 重组病毒感染MSCs的实验分组

1．8 HSV-1重组病毒对MSCs细胞增殖的影响

1．9 MSCs细胞中VEGF165和MBP4的表达

1．10 统计分析方法

2 结果

2．1 日本大耳白兔MSCs细胞转染后的形态学观察

2．2 HSV-1-VEGF165-BMP4病毒感染MSCs细胞效率的观察

2．3 HSV-1-VEGF165-BMP4病毒感染对MSCs细胞增殖的影响

2．4 VEGF165及BMP4基因在MSCs细胞中的表达

3 讨论

4 结论

实验三 HSV-1-VEGF165-BMP4感染MSCs细胞体外及体内成骨能力的检测

前言

1 实验材料和方法

1．1 主要试剂

1．2 主要仪器

1．3 HSV-1-VEGF165-BMP4感染MSCs后成骨能力的检测

1．4 组织工程骨的体外构建

1．5 BG／MSCs复合物培养Hoechst比色法检测MSCs的增殖能力

1．6 BG／MSCs复合物培养电镜扫描观察

1．7 碱性磷酸酶(ALP)的检测

1．8 骨胶原蛋白表达的检测

1．9 骨钙素的检测

1．10 统计学方法

2 结果

2．1 细胞成骨能力检测结果

2．2 BG／MSCs细胞复合物体外培养后MSCs增殖能力

2．3 MSCs细胞在支架上生长情况的电镜观察

2．4 MSCs细胞与BG复合物体外培养后ALP活性

2．5 MSCs细胞与BG复合物体外培养后骨胶原及骨钙素分泌情况

3 讨论

4 结论

实验四 HSV-1-VEGF165-BMP4组织工程骨复合生物活性玻璃修复兔桡骨缺损的研究

前言

1 实验材料和方法

1．1 主要仪器及器材

1．2 主要试剂

1．3 动物模型的制备

1．4 实验分组

1．5 各组治疗后的大体观察

1．6 X线观察

1．7 骨密度检测

1．8 生物力学检测

1．9 组织学检测

1．10 统计分析

2 结果

2．1 大耳白兔术后治疗观察

2．2 X线观察

2．3 X射线阻射密度分析

2．4 骨密度检测

2．5 生物力学测试

2．6 组织学评分

2．7 组织形态学观察

3 讨论

4 结论

参考文献

综述 组织工程骨研究进展

致谢