肿瘤抑制基因p53抑制鳜传染性脾肾坏死病毒和弹状病毒增殖的研究

摘要

鳜是我国主要的高值经济养殖鱼类之一，随着养殖密度的提高，病害越发严重，其中鳜传染性脾肾坏死病毒病(ISKNVD)和弹状病毒病(SCRVD)是阻碍鳜养殖业健康发展的最主要病毒病，因此对其开展防治研究非常必要。p53是一种重要的肿瘤抑制因子，具有调节细胞周期、控制细胞死亡和分化、参与细胞凋亡等功能。近年来研究发现，p53蛋白在细胞先天性抗病毒免疫中发挥着重要的作用。本论文以鳜为研究对象，克隆、表达了鳜p53基因，制备了其多克隆抗体，在此基础上，开展了p53对ISKNV和SCRV感染的响应模式研究，并进一步对其抗病毒功能进行了确定。取得的结果如下:
　　1、获得了鳜p53序列并制备其多克隆抗体，探讨了鳜p53对ISKNV和SCRV感染的响应模式。鳜p53(Sc-p53)的cDNA全长为1，5555p，编码380个氨基酸，5'和3'非编码区分别为165bp和247bp。Sc-p53蛋白同其他物种p53蛋白一样，在结构上也含有5个进化上高度保守的区域，是p53功能的关键位点。系统进化分析表明，鳜p53与雀鲷等鲈形目亲缘关系最近。构建了鳜p53原核表达载体pET30a-Scp53，将其转化大肠杆菌BL21，在IPTG的诱导下表达了Sc-p53，Sc-p53蛋白以包涵体形式存在。将纯化的Sc-p53重组蛋白免疫兔子，制备了抗Sc-p53的兔多克隆抗体。荧光定量PCR检测健康鳜的Sc-p53mRNA在各个组织中呈组成型表达，主要表达于鳃和后肾。Western blotting检测发现健康鳜的Sc-p53在肝脏、鳃、脾脏、胃和心脏中表达。ISKNV感染鳜后，Sc-p53在鳜脾脏中表达呈现双相性上升的变化，在感染3h时表达显著上调，随后表达下降，然后在48h至7d表达再次显著上调;ISKNV感染鳜脑细胞(CPB)后的表达趋势与鳜脾脏情况相似。Western blotting检测结果显示ISKNV感染CPB细胞后p53蛋白水平也呈现双相性上升的变化。然而，SCRV感染鱼体和细胞后Sc-p53表现出不同的表达模式。SCRV感染鳜后在脾脏组织中表达情况是感染24h后表达显著上调，而感染CPB细胞后，Sc-p53在感染6h表达显著上调。Western blotting检测SCRV感染CPB后，p53蛋白在感染1h后表达显著上调，持续上升到感染4h，而后下降。
　　2、获得了鳜p53的基因组结构及其一种新的剪接异构体(Sc-p53I6)，在此基础上进一步探讨了Sc-p53I6对ISKNV和SCRV感染的响应模式。鳜p53基因组全长为5，543bp，包含10个内含子和11个外显子。采用RACE-PCR的方法获得了鳜p53的一种新的剪接异构体(Sc-p53I6)，其cDNA全长为1，106bp，编码254个氨基酸，5'和3'非编码区分别为165bp和179bp。相比Sc-p53，Sc-p53I6的cDNA全长少了5个外显子，并保留了第六个内含子的一部分。荧光定量PCR检测发现Sc-p53I6在健康鳜的各个组织中也呈组成型表达，主要表达于鳃、血细胞和后肾中。Western blotting结果显示Sc-p53I6在健康鳜的肝脏、头肾、中肾、胃和心脏中表达。ISKNV感染鳜后，Sc-p53I6在鳜脾脏中的转录表达也呈现双相性上升的变化，在感染6h表达显著上调，随后表达下降，然后在48-72h表达再次显著上调;ISKNV感染鳜脑细胞后的转录表达趋势与鳜脾脏表达趋势相似。SCRV感染鳜后Sc-p53I6在脾脏组织中转录表达情况呈现出不同的表达模式，只表现一次上升的变化，感染12h后表达显著上调;感染CPB细胞后在感染4h表达显著上调。
　　3、为了研究鳜p53的抗病毒功能，构建了鳜p53敲降CPB细胞系，在此基础上，进一步探讨了鳜p53敲降CPB细胞系对ISKNV和SCRV病毒增殖复制的影响。首先构建了p53基因的RNA干扰真核表达载体pMAGic-Scp53A和pMAGic-Scp53B。将构建好的干扰载体转染CPB细胞，获得稳定转染细胞系，将其命名为CPB-p53kd-A和CPB-p53kd-B。通过荧光定量PCR和Western blotting检测其干扰效率，qRT-PCR结果表明CPB-p53kd-A和CPB-p53kd-B干扰效率分别为63％、60％;Western blot结果表明，CPB-p53kd-A和CPB-p53kd-B干扰效率分别为79.42％、78.28％，表明成功获得了两个鳜p53敲降CPB细胞系。然后采用ISKNV和SCRV分别感染鳜p53敲降CPB细胞系，结果显示，与对照组相比，在CPB-p53kd-A和CPB-p53kd-B中，ISKNV和SCRV的病毒拷贝数及ISKNV-MCP和SCRV-N蛋白的表达均显著增加，且增加水平与敲降效率呈正相关。
　　4、促进鳜p53表达抑制了ISKNV和SCRV病毒的增殖复制。添加5-氟尿嘧啶可以增强鳜p53蛋白的表达，ISKNV和SCRV感染后，与对照组相比，添加5-氟尿嘧啶组ISKNV和SCRV的病毒拷贝数及ISKNV-MCP和SCRV-N蛋白的表达均显著降低。
　　综上所述，ISKNV和SCRV在鳜p53敲降CPB细胞系中的增殖复制显著增加，促进鳜p53表达后，ISKNV和SCRV病毒增殖复制显著降低。表明鳜p53在ISKNV和SCRV病毒增殖复制中发挥着重要的抗病毒作用。

目录

声明

摘要

1 p53基因研究概况

1．1 p53的认知过程

1．2 p53蛋白的结构

1．3 p53蛋白的功能

1．4 p53的作用机制

1．5 p53功能的调节

1．6 p53蛋白抗病毒功能研究进展

2 鱼类p53基因研究概述

3 鳜病毒研究进展

3．1 传染性脾肾坏死病毒概述

3．2 鳜弹状病毒概述

4 本研究问题的由来、目的和意义

1 试验材料

1．1 实验鱼、细胞和病毒

1．2 实验主要试剂

1．3 主要设备

2 试验方法

2．1 CPB细胞培养

2．2 DNA和RNA的提取

2．3 cDNA的合成

2．4 鳜p53基因核心区域的扩增

2．5 SMART cDNA第一链的合成

2．6 RACE-PCR扩增鳜p53 cDNA末端

2．7 鳜p53基因组DNA的克隆

2．8 鳜p53序列生物信息学分析

2．9 鳜p53原核表达和免多克隆抗体的制备

2．10 细胞和组织样品取样

2．11 病毒滴度测定方法

2．12 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

2．13 蛋白印迹(Western blotting)分析

2．14 CPB细胞和鳜鱼鱼体的病毒感染和样品收集

2．15 鳜p53及其异构体mRNA在不同组织中的表达

2．16 鳜p53 RNA干扰载体的构建

2．17 初筛嘌呤霉素对CPB细胞的最低致死浓度

2．18 细胞瞬时与稳定转染

2．19 细胞生长曲线

2．20 鳜p53敲降细胞系的干扰效率的检测

2．21 鳜p53敲降细胞系对ISKNV和SCRV增殖复制的影响

2．22 病毒蛋白检测

2．23 细胞活力的测定

2．24 5-Fu处理CPB细胞对鳜p53蛋白的影响

2．26 统计分析

第三章 试验结果与分析

1 鳜肿瘤抑制基因p53的克隆、表达模式及其对病毒的响应研究

1．1 鳜p53中间片段扩增结果

1．2 鳜p53 cDNA全长及推导的氨基酸序列

1．3 鳜p53与其他物种的同源性分析

1．4 鳜p53蛋白的诱导表达

1．5 鳜p53兔多抗血清效价

1．6 鳜p53免多克隆抗体纯化

1．7 鳜p53兔多抗的Westem blotting检测

1．8 鳜p53在健康鳜各个组织中的表达

1．9 鳜p53在病毒感染后的表达谱

2 鳜p53的基因组结构特征

2．1 鳜肿瘤抑制基因p53的基因结构分析

2．2 鳜p53蛋白5个高度保守区域在基因组上的位置分析

3．1 鳜p53选择性剪接异构体的cDNA全长及推导的氨基酸序列

3．2 Sc-p53I6在健康鳜各个组织中的表达

3．3 Sc-p53I6在病毒感染后的表达谱

4 鳜p53敲降CPB细胞系的建立及其对ISKNV和SCRV增殖复制的影响

4．1 pMAGic 7．1 载体的酶切鉴定结果

4．2 pMAGic 7．1 -p53质粒的酶切鉴定

4．3 鳜p53敲降CPB细胞系的建立

4．4 细胞生长曲线

4．5 鳜p53敲降CPB细胞系mRNA表达变化

4．7 鳜p53敲降CPB细胞系对细胞内病毒增殖复制的影响

5 促进鳜p53表达对ISKNV和SCRV增殖复制的影响

5．2 5-Fu处理CPB细胞p53蛋白表达情况

5．3 5-Fu处理CPB细胞对病毒增殖复制的影响

第四章 讨论

全文总结

参考文献

作者简历

致谢