盾壳霉对两种除草剂的敏感性评价及谷氨酰胺合成酶功能研究

摘要

盾壳霉（Coniothyrium minitans）作为防治菌核病的生物制剂已经被大量研究。本论文主要研究盾壳霉与田间两种灭生型除草剂草甘膦和草铵膦共同施用问题，并针对试验过程中出现的现象，主要研究了除草剂草铵膦的靶标基因在盾壳霉生长过程中的功能。试验结果如下:
　　1.盾壳霉对两种除草剂敏感性评价:草甘膦和草铵膦对盾壳霉菌丝均有较强抑制作用，EC50分别为714.3μg/mL和574.5μg/mL;对孢子抑制作用相对较弱，草甘膦EC50为1019.8μg/mL，而草铵膦对盾壳霉孢子的萌发基本没有抑制作用;对核盘菌菌丝均有较强的抑制作用，EC50分别为1695.8μg/mL和223.5μg/mL，草铵膦较草甘膦抑制作用更为显著;两种除草剂存在下会延迟盾壳霉孢子的萌发时间，但是对盾壳霉孢子没有杀灭作用;两种除草剂存在下，会影响盾壳霉对核盘菌菌核的寄生，草铵膦较草甘膦抑制作用更为显著。但结合两种除草剂的性质，草铵膦在田间能快速被降解且不能杀灭孢子，草甘膦也不能杀灭孢子且在较高浓度下仍对盾壳霉寄生核盘菌菌核没有太大影响。所以，在田间正常条件下盾壳霉孢子均可以和两种除草剂进行混合施用。
　　2.盾壳霉在含草铵膦的PDA平板上生长异常，推测草铵膦的靶标对盾壳霉的生长起重要作用，为了探究生长异常原因，了解草铵膦的作用机理，为研究抗药性材料提供依据，我们研究了草铵膦对盾壳霉的作用。盾壳霉中存在三个含有谷氨酰胺合成酶保守结构域的基因，其中一个为FluG蛋白，另外两个为谷氨酰胺合成酶类似蛋白，将其分别命名为GlnA1（CmZS1_02675）和GlnA2(CmZS1_07614)。基因GlnA1敲除会使盾壳霉致死，加入一定量谷氨酰胺之后，敲除转化子可以恢复生长和产孢，但是菌落偏白，疑似黑色素产量降低，且加入其它类氨基酸不能恢复其生长和产孢。耐药性试验表明，草铵膦对GlnA1敲除转化子无抑制作用。GlnA2敲除转化子与菌株ZS-1相比，在菌落形态、菌丝尖端、生长、产孢、生物学产量和对草铵膦的抗药性方面均无显著差异。因此可以确定，在盾壳霉中GlnA1为除草剂草铵膦的靶标，而GlnA2不是。

目录

声明

摘要

缩略词表

1．1．1 菌核病的危害

1．1．2 菌核病的防治

1．2 盾壳霉的研究

1．2．1 盾壳霉的生物学特性和生防机制

1．2．2 盾壳霉生物制剂及对菌核病的防治

1．2．3 盾壳霉对除草剂敏感性

1．3 草甘膦与草铵膦概述

1．3．1 草甘膦概述

1．3．2 草铵膦综述

1．4 研究目的及意义

第二章 盾壳霉对两种除草剂的敏感性评价

2．1 试验材料

2．1．1 供试菌株和试剂

2．1．2 盾壳霉分生孢子、除草剂母液的配制

2．2 试验方法

2．2．1 草甘膦和草铵膦原药对盾壳霉菌丝生长和分生孢子萌发的影响

2．2．2 草甘膦和草铵膦原药对核盘菌1980菌丝生长的影响

2．2．3 草甘膦和草铵膦商品制剂对盾壳霉孢子致死或抑制的研究

2．2．4 草甘膦和草铵膦商品制剂对盾壳霉寄生核盘菌菌核的影响

2．3 结果与分析

2．3．1 草甘膦和草铵膦原药对盾壳霉菌丝孢子的影响

2．3．2 草甘膦和草铵膦原药对核盘茵菌丝生长的影响

2．4．3 草甘膦和草铵膦商品药剂对盾壳霉孢子萌发的影响

2．4．4 草甘膦和草铵膦商品制剂对盾壳霉寄生核盘菌菌核的影响

2．4 小结与讨论

第三章 盾壳霉谷氨酰胺合成酶基因功能研究

3．1 试验材料

3．1．1 菌株

3．1．2 载体

3．1．3 培养基

3．1．4 试剂

3．1．5 生物酶

3．1．6 主要仪器

3．2 试验方法

3．2．1 盾壳霉谷氨酰胺合成酶基因的获得

3．2．2 总RNA的提取

3．2．3 cDNA的合成

3．2．4 盾壳霉谷氨酰胺合成酶基因的末端克隆

3．2．5盾壳霉谷氨酰胺合成酶基因在盾壳霉中表达动态

3．2．6 同源重组方法敲除盾壳霉中GlnA1和GlnA2基因

3．2．7 GlnA1互补转化子的获得与验证

3．2．8 不同浓度谷氨酰胺下GlnA1基因敲除转化子的菌落形态、生长及产孢统计

3．2．9 其他物质对GlnA1基因敲除转化子生长恢复情况

3．2．12 GlnA1敲除转化子对草铵膦的敏感性研究

3．2．14 GInA1转化子中ROS含量

3．2．15 GlnA2敲除转化子的生物学特性分析

3．2．16 GlnA2敲除转化子对草铵膦的敏感性研究

3．3 结果

3．3．1 盾壳霉在含草铵膦的PDA平板上生长异常

3．3．2 盾壳霉谷氨酰胺合成酶基因的全长克隆与分析

3．3．3 盾壳霉谷氨酰胺合成酶基因的表达动态

3．3．4 GlnA1和GlnA2敲除转化子的获得与验证

3．3．5 GlnA1互补转化子PCR验证

3．3．7 仅谷氨酰胺可以恢复GlnA1敲除转化子生长

3．3．8 GlnA1敲除转化子孢子在PDA中的萌发率

3．3．9 GlnA1敲除转化子寄生核盘菌能力

3．3．10 GInA1敲除转化子对草铵膦不敏感

3．3．11 GlnA1互补转化子生物学性状测定

3．3．12 GlnA1转化子中ROS含量

3．3．13 GlnA2敲除转化子生物学特性测定

3．3．14 GlnA2敲除转化子对草铵膦敏感

3．4 小结与讨论

第四章 总结与展望

参考文献

附录

致谢