托吡酯对戊四氮点燃大鼠行为、EEG和海马可塑性变化影响的研究

摘要

目的：目前为止，癫痫的发病机制和病因学还不是特别清楚，已在许多颞叶癫痫模型和颞叶癫痫病人的海马上发现诸如进行性神经元丢失、胶质细胞增生和突触重建等神经可塑性改变。癫痫形成中的神经可塑性研究已经成为当前癫痫研究的热点。点燃是研究癫痫形成和神经可塑性的一个理想模型。托吡酯是一种新型抗癫痫药，通过多重作用机制发挥抗癫痫作用。本研究通过戊四氮点燃大鼠模型，观察戊四氮点燃过程中大鼠行为、脑电活动变化以及突触重建标记物生长相关蛋白43、胶质细胞增生标志物胶质细胞纤维酸性蛋白和细胞因子白介素-6在海马表达的变化及托吡酯对其变化的影响，探讨神经可塑性在癫痫发病中的作用，从而为新的治疗思路提供理论依据。 方法：1.健康成年雄性SD大鼠80只，随机分为4组，每组20只。Ⅰ组大鼠胃管内注入生理盐水(10ml/kg)后1小时腹腔注射10g/L戊四氮(35mg/kg)；Ⅱ组和Ⅲ组大鼠腹腔注射戊四氮(剂量同Ⅰ组大鼠)前1小时分别按100mg/kg和40mg/kg胃灌注10g/L托吡酯生理盐水溶液；Ⅳ组大鼠按10ml/kg和3.5ml/kg分别胃灌注和腹腔注射生理盐水，间隔1小时。均每日一次。注射完毕后观察1小时，记录痫性发作的潜伏期及痫性发作级别。各组选取2个研究时间点，又相应分为两个亚组，分别为Ⅰ组大鼠行为达到Ⅲ级和Ⅴ级时，每个时间点各组大鼠为10只。 2.在每个时间点，各组大鼠做脑电图描记。除对照组外，余三组均在描记中腹腔注射相同剂量戊四氮，用药前描记脑电图10分钟，用药后至少连续描记30分钟。 对所有大鼠的脑电图进行定量分析。描记后将大鼠处死。 3.应用免疫组织化学方法检测不同时间点各组大鼠齿状回、海马CA3区和CA1区内生长相关蛋白43、胶质纤维酸性蛋白和细胞因子白介素-6的表达。相关结果经图像分析系统进行定量分析。 4.应用逆转录聚合酶联反应，半定量检测不同时间点各组大鼠齿状回、海马CA3区及CA1区内生长相关蛋白43、胶质纤维酸性蛋白mRNA的表达。 结果：1.Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组大鼠腹腔注射戊四氮后，Ⅰ组大鼠在连续腹腔注射10天后陆续出现1-2级发作，约2周达到Ⅲ级。Ⅱ组和Ⅲ组大鼠于用药后两周出现1-2级发作，4周时，Ⅰ组所有动物达到点燃状态，而Ⅱ组和Ⅲ组大鼠最高发作级别为3级。对照组大鼠行为正常，无痫性发作。 2.脑电图描记时间为2周和4周。对照组的脑电记录显示正常。2周及4周时，Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组大鼠脑电记录可见癫痫波发放，Ⅰ组大鼠脑电记录到的癫痫波多于Ⅱ组和Ⅲ组大鼠。与Ⅰ组大鼠相比，Ⅱ组和Ⅲ组大鼠发作的潜伏期延长，持续时间缩短(均p＜0.05)。2周时Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组大鼠注射PTZ后总功率、δ、θ和α功率均增加(p＜0.05或p＜0.01)，β功率无显著性改变(P＞0.05)。4周时，Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组大鼠除Ⅰ组大鼠β功率无显著性改变外(P＞0.05)，注射PTZ后总功率和其他各频段功率均增加(p＜0.05或p＜0.01)。 3.在同一个时间点，与对照组相比，Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组大鼠CA3区苔状纤维层，齿状回的内分子层及上颗粒层生长相关蛋白43免疫反应着色增强，图像分析结果显示，Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组大鼠CA3区苔状纤维层，齿状回的内分子层及上颗粒层免疫反生长相关蛋白43映光密度值比对照组均有统计学意义的增高(p＜0.05)；与Ⅰ组相比，Ⅱ组和Ⅲ组大鼠GAP-43免疫反应光密度值有统计学意义的降低(p＜0.05)，Ⅱ组和Ⅲ组大鼠之间无差异(P＞0.05)。与两周时相比，四周时Ⅰ组，Ⅱ组和Ⅲ组大鼠CA3区苔状纤维层，齿状回的内分子层及上颗粒层生长相关蛋白43免疫反应着色进一步变强，与两周时相比生长相关蛋白43免疫反应光密度值有统计学意义的增高(p＜0.05)。 4.在同一个时间点，与对照组相比，Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组大鼠齿状回及海马CA各区胶质细胞纤维酸性蛋白免疫阳性反应增强，以齿状回的门区及CA1腔隙-分子层更显著，可见胶质细胞纤维酸性蛋白免疫阳性反应细胞增多，胶质细胞胞体肥大不明显，突起增多，免疫阳性细胞计数有显著性差异(p＜0.05)。Ⅱ组和Ⅲ组大鼠齿状回、海马CA1区及CA3区胶质细胞纤维酸性蛋白免疫阳性反应细胞数较Ⅰ组减少，有显著性差异(p＜0.05)，而Ⅱ组和Ⅲ组大鼠之间无显著性差异(p＞0.05)。与两周时相比，四周时Ⅰ组Ⅱ组和Ⅲ组大鼠齿状回、CA1区及CA3区胶质细胞纤维酸性蛋白免疫阳性反应进一步增强，免疫反应阳性细胞数进一步增多，与两周时有显著性差异(p＜0.05)。 5.2周时，Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组大鼠齿状回、海马CA3区及CA1区内白介素6免疫反应均比对照组增强(均p＜0.05)，表现为阳性反应细胞数目增多，着色明显加深，三组之间光密度值无显著性差异(P＞0.05)。4周时，Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组大鼠齿状回、海马CA3区及CA1区内白介素6免疫反应进一步增强(p＜0.05)，Ⅰ组比Ⅱ组和Ⅲ组大鼠齿状回、海马CA3区及CA1区内白介素6免疫反应更明显，差异有显著性(均p＜0.05)，而Ⅱ组和Ⅲ组大鼠之间光密度值无显著性差异(P＞0.05)。 6.生长相关蛋白43mRNA逆转录聚合酶联反应产物经溴乙啶显色后清晰地显示出256bp和385bp两个预期的条带，Ⅳ组大鼠之间齿状回、CA1区及CA3区的生长相关蛋白43mRNA表达水平无统计学差异(p＞0.05)。在同一时间点，Ⅰ组，Ⅱ组和Ⅲ组大鼠齿状回及CA3区的生长相关蛋白43mRNA表达强于对照组(p＜0.05)，各组在海马CA1区生长相关蛋白43mRNA表达无差异；Ⅱ组和Ⅲ组大鼠齿状回和CA3区的生长相关蛋白43mRNA表达水平较Ⅰ组有统计学意义的降低(p＜0.05)，而Ⅱ组和Ⅲ组大鼠之间齿状回和CA3区的生长相关蛋白43mRNA表达水平无统计学差异(p＞0.05)。与2周时相比，四周时Ⅰ组大鼠，Ⅱ组和Ⅲ组大鼠齿状回和CA3区的生长相关蛋白43mRNA表达水平进一步增强(p＜0.05)。 7.胶质细胞纤维酸性蛋白mRNA逆转录聚合酶联反应产物经溴乙啶显色后清晰地显示出256bp和385bp两个预期的条带，Ⅳ组大鼠之间齿状回，CA1区及CA3区的胶质细胞纤维酸性蛋白mRNA表达水平无统计学差异(p＞0.05)。在同一时间点，Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组大鼠齿状回，CA1区及CA3区的胶质细胞纤维酸性蛋白mRNA表达强于对照组(p＜0.05)，与Ⅰ组相比，Ⅱ组和Ⅲ组大鼠齿状回，CA1区及CA3区的胶质细胞纤维酸性蛋白mRNA表达水平有显著的下降(p＜0.05)。而在不同时间点，Ⅱ组和Ⅲ组大鼠之间齿状回，CA1区及CA3区的胶质细胞纤维酸性蛋白mRNA表达水平无差异(p＞0.05)。与2周时相比，Ⅰ组大鼠、Ⅱ组和Ⅲ组齿状回，CA1区及CA3区的胶质细胞纤维酸性蛋白mRNA表达水平进一步增强(p＜0.05). 结论：1.戊四氮点燃大鼠海马生长相关蛋白43、胶质原纤维酸性蛋白和白介素-6的表达增强，表明反应性胶质细胞增生、突触重建和免疫系统激活参与了癫痫发生的病理过程。 2.托吡酯对戊四氮点燃的大鼠癫痫发作行为有抑制作用，两种剂量的抑制作用无差异。 3.脑电图定量分析显示托吡酯可抑制戊四氮点燃的大鼠大脑神经元癫痫样放电。 4.托吡酯可抑制戊四氮点燃大鼠海马生长相关蛋白43、胶质细胞纤维酸性蛋白和白介素-6的过表达，两种剂量的抑制作用无差异。 5.托吡酯可通过抑制戊四氮诱导的大鼠海马异常神经网络的建立阻止癫痫形成。

目录

前言

第一部分 托吡酯对戊四氮点燃癫痫大鼠行为和脑电图改变的影响

第二部分 托吡酯对戊四氮点燃大鼠海马胶质增生和突触重建的影响

第三部分 托吡酯对戊四氮点燃大鼠海马白介素-6表达的影响

小结

颞叶癫痫海马可塑性变化研究进展

英文缩写简表

在校期间发表论文及获奖

致谢