经侧脑室单次注射Forskolin对大鼠海马tau蛋白磷酸化和空间记忆能力的影响及二者之间的关系

摘要

过度磷酸化的tau蛋白是阿尔茨海默病(Alzheimer'sDisease，AD)患者脑神经元中以双股螺旋丝(pariedhelicalflaments，PHF)为基本单位的神经原纤维缠结(neurofibrillarytangles，NFT)的主要成分，而后者是AD的特征性病理改变之一[1-3]。tau蛋白是一种微管相关蛋白，它能增加微管组装速度并在生长端降低微管分子解聚速度，在AD患者脑中过度磷酸化的tau蛋白已丧失其生物学功能，从而导致微管解聚、轴突转运受损和神经元退行性变[4-5]。至今，国际尚无公认的神经元退行性变的动物模型。我们最近的研究显示：在大鼠侧脑室注射一种cAMP-依赖性蛋白激酶A(cAMPdependentproteinkinase，PKA)的特异性激动剂Forskolin后，在24h时引起tau蛋白过度磷酸化和大鼠空间记忆障碍[6]。为了进一步探讨：1、在成年大鼠进行侧脑室注射不同浓度PKA的特异性激动剂Forskolin后，在同一时间点观察PKA激活后对大鼠海马tau蛋白磷酸化程度和空间记忆的影响及二者之间的关系；2、结合第一步的实验结果，选择最佳浓度后在成年大鼠进行侧脑室注射同一浓度的Forskolin后，在不同的时间点观察其对大鼠海马tau蛋白磷酸化和空间记忆保留能力的影响的持续时间以及两种病理改变之间的关系。经侧脑室注射PKA的激动剂-Forskolin，用特定抗体通过免疫印迹和免疫组织化学的方法检测大鼠海马tau蛋白磷酸化水平的改变，同时用Morris水迷宫法检测大鼠空间记忆能力。我们观察到的结果如下： 一、不同浓度的Forskolin对大鼠海马tau蛋白磷酸化和空间保留记忆能力的影响及两者之间的关系 分别将40μl的0μM、20μM、40μM、80μM、120μM、160μM及200μM的Forskolin经侧脑室注入大鼠24h后免疫印迹和免疫组化的结果显示：1、大鼠海马的tau蛋白PHF-1位点(Ser-396/404)和PS214位点(Ser-214)的磷酸化程度及Tau-1位点(Ser-198/199/202)的非磷酸化水平降低程度在20μM时即明显升高(P＜0.05)，从20μM到80μMForskolin引起的tau蛋白的在这些位点的磷酸化程度依次增强；而从80μM到200μMForskolin引起的tau蛋白的在这些位点的磷酸化程度则依次减弱；其中80μMForskolin引起的tau蛋白的在这些位点的磷酸化程度最强(P＜0.01)，而200μMForskolin对tau蛋白这些位点的磷酸化的作用不明显(P＞0.05)。2、80μMForskolin对蛋白磷酸酯酶2A(ProteinPhosphatase-2A，PP2A)的催化亚基无明显的影响(P＞0.05)；200μMForskolin则使PP2A催化亚基的活性明显增强(P＜0.01)。水迷宫的实验结果显示：80μMForskolin能明显的引起大鼠的空间记忆保留能力障碍(P＜0.01)；而200μMForskolin对其的影响不明显(P＞0.05)。将大鼠空间记忆保留障碍与海马tau蛋白磷酸化作相关性分析结果显示：大鼠空间记忆保留障碍与海马tau蛋白PHF-1位点的磷酸化程度呈正相关(r=0.998，P＜0.05)；与海马tau蛋白Tau-1位点的非磷酸化程度呈负相关(r=-0.997，P＜0.05)；而与海马tau蛋白PS214位点的磷酸化程度无相关性(r=0.91，P＞0.05)。注射不同浓度的Forskolin(0μM、80μM和200μM)后48h，对大鼠海马tau蛋白磷酸化和空间保留记忆影响的趋势与24h时一致。 二、单次侧脑室注射同一浓度Forskolin后，大鼠海马tau蛋白磷酸化和空间保留记忆障碍变化的时相特点及二者之间的关系。 根据第一步的实验结果，本研究选择了80μM的Forskolin作为最佳浓度注射。免疫印迹与免疫组化的结果显示：tau蛋白在Ser-396/404和Ser-214位点的过度磷酸化水平及Ser-198/199/202位点非磷酸化水平降低的程度在24h，48h和72h均有显著升高(P＜0.05)，在48h时达到高峰(P＜0.01)，而在72h时则呈恢复趋势。水迷宫的结果显示：大鼠在注射后24h，48h和72h均有空间记忆障碍(P＜0.05)，且这种记忆障碍在48h最明显(P＜0.01)，在72h时亦呈明显恢复趋势；大鼠海马tau蛋白过度磷酸化和空间保留记忆障碍之间作相关性分析结果显示：大鼠空间记忆保留障碍与海马tau蛋白PHF-1位点的磷酸化程度呈正相关(r=0.97，P＜0.05)；与海马tau蛋白Tau-1位点的非磷酸化程度呈负相关(r=-0.963，P＜0.05)；而与海马tau蛋白PS214位点的磷酸化程度无相关性(r=0.705，P＞0.05)。 结论：1、不同浓度的PKA的特异性激动剂Forskolin对大鼠海马tau蛋白磷酸化和空间记忆保留能力的影响不同，80μMForskolin对其的作用能力最强，200μMForskolin对其基本不影响。2、大鼠侧脑室单次注射80μMForskolin只在一定时间内引起大鼠海马tau蛋白过度磷酸化和动物空间记忆保留障碍，以48h时作用最强。3、Forskolin引起大鼠海马tau蛋白过度磷酸化和空间记忆保留障碍的改变趋势存在一定的相关性。

目录

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摘要

前言

材料和方法

结果

讨论

小结

创新点

参考文献

综述阿尔茨海默病早期诊断的研究进展

致谢