宫颈癌中Pin1过表达对cyclin D1调节及其在宫颈癌细胞增殖凋亡的作用机制研究

摘要

蛋白质序列中丝/苏-脯氨酰基序的磷酸化是一个重要的细胞内信号机制，主要关系到细胞增殖和转化。近年来研究发现：磷酸化的丝/苏-脯氨酰基序还需要被Pin1特异识别催化，依赖Pin1的构型转变是新的蛋白磷酸化后调节机制，对细胞增殖和恶性转化起着非常重要的调节作用，其功能失调可导致细胞转化和肿瘤发生。Pin1在人类多种肿瘤中存在过表达，对多种致癌信号具有协同加强作用，被称为肿瘤发生发展的“催化分子”。Pin1过表达在实体瘤如乳腺癌、前列腺癌发生中起关键的催化作用，且与临床预后密切相关。宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤，属于实体瘤，是导致妇女发生癌相关死亡的首要原因。尽管宫颈癌发生的确切的分子机制并不清楚，但研究表明：HPV与宫颈癌关系密切，在HPVE6/E7致癌信号通路中，多种癌信号分子因含有共同的丝/苏-脯氨酰基序可能受Pin1特异性调控，如cyclinD1，Ki67，P53NF-κB等，其中cyclinD1过度表达可加速细胞增殖，在HPVE6/E7致癌中扮演着重要角色，cyclinD1是HPVE6/E7致癌所必不可少的成分。体内、外研究显示：删除cyclinD1，则HPVE6/E7不能诱导正常细胞转化增殖。但cyclinD1过表达的机制不明。有趣的是Pin1过表达不仅在转录水平促进cyclinD1表达，而且还通过催化cyclinD1发生顺反异构，阻止其降解，导致cyclinD1蓄积于细胞核内，处于持续激活状态，加速乳腺上皮细胞增殖和肿瘤发生。推测Pin1可能也作为催化分子经上调cyclinD1参与宫颈癌发生，Pin1过表达过度激活cyclinD1可加强致癌信号、扰乱细胞内信号稳态，可能是引起宫颈上皮细胞发生恶性转化和增殖失控的重要因素。然而，Pin1在宫颈癌中表达及其与cyclinD1关系的研究尚未见报道，阻抑Pin1是否影响宫颈癌细胞增殖和肿瘤形成亦不清楚。因此本课题拟进行如下研究： 目的：1.明确Pin1、cyclinD1在宫颈癌中的表达状况及其临床意义；2.研究Pin1在宫颈癌发生发展中可能的作用及对cyclinD1表达的影响；3.探索靶向Pin1基因沉默阻抑宫颈癌发生和细胞增殖的可能性。 方法：1.免疫组织化学法检测57例宫颈癌，21例CIN，10例正常宫颈组织中Pin1，cyclinD1和Ki67的表达，分析其相关性及临床意义；同时RT-PCR法检测其中15例宫颈癌，5例正常宫颈组织中Pin1mRNA的表达； 2.RT-PCR，免疫印迹法和免疫细胞化学法检测4株宫颈癌细胞HeLa，Siha，C33a，Caski中Pin1mRNA和蛋白的表达； 3.构建Pin1正义质粒，上调Pin1基因表达；免疫印迹法，MTT比色法，软琼脂克隆形成实验，流式细胞仪分析上调Pin1基因对cyclinD1表达及宫颈癌细胞增殖、凋亡的影响； 4.应用RNA干扰技术，短发夹状RNA特异性沉默Pin1基因表达；免疫印迹法，MTT比色法，软琼脂克隆形成实验，流式细胞仪分析下调Pin1基因对cyclinD1表达及宫颈癌细胞增殖、凋亡的影响。 结果：1.宫颈癌组织中Pin1mRNA和蛋白表达明显高于正常宫颈组织(p＜0.05)；从正常宫颈到CIN再到浸润癌Pin1蛋白表达逐渐增强(p＜0.05)；Pin1蛋白过表达与临床分期、病理分级、淋巴结转移无明显相关(p＞0.05)；但宫颈腺癌中Pin1表达明显高于宫颈鳞癌(p＜0.05)；Pin1过表达与cyclinD1，Ki67表达密切相关(p＜0.05)。 2.HeLa、Siha、C33a、Caski宫颈癌细胞株存在不同程度Pin1mRNA及蛋白过表达(p＜0.05)。 3.在宫颈癌HeLa细胞中，上调Pin1可增加内源性cyclinD1表达，下调Pin1可降低内源性cyclinD1表达(p＜0.05)。 4.特异性沉默Pin1基因可阻抑宫颈癌细胞增殖并诱导凋亡(p＜0.05)；外源性增加Pin1基因表达对宫颈癌细胞增殖和凋亡无明显影响(p＞0.05)。 结论：1.Pin1在宫颈癌组织和细胞中均存在mRNA及蛋白水平上的过表达，Pin1过表达与cyclinD1，Ki67表达密切相关，Pin1过表达与宫颈癌细胞增殖失控有关。 2.Pin1表达异常可能参与宫颈癌的发生发展，其发挥促癌作用的分子机制之一是调节内源性cyclinD1表达。 3.Pin1可能成为宫颈癌新的诊断和治疗靶点，以Pin1为靶向的RNA干扰技术有望应用于宫颈癌防治。

目录

摘要

绪言

第一部分Pin1在宫颈癌中表达及其临床意义

第二部分Pin1对cyclin D1表达及宫颈癌细胞增殖凋亡的影响

全文讨论

总结

参考文献

英文论文

综述一 肿瘤发生的催化分子——肽基脯氨酰顺反异构酶Pin1

综述二 RNA干扰技术及其在肿瘤研究中的应用

附录一 博士在读期间撰写文章

附录二 英文缩略语

致谢