CRISPR-Cas系统对老汉瓜ACC合成酶基因定点敲除及功能验证

摘要

甜瓜（Cucumis melo L.）属葫芦科黄瓜属，是一种深得人们喜爱的水果，而“老汉瓜”维吾尔语称之为“比歇克吉”，学名为歇克甜瓜，是新疆特产，具有柔软可口、水分多、糖度高等特点，受到广大消费者欢迎。由于老汉瓜成熟以后，其软化的速度很快，对储藏和运输造成了很大的困难，使经济受到了很大的损失。因此，提高果实的耐储藏性成为生产上必须要解决的难题，也是甜瓜育种的重要目标。随着科学技术的发展，人们发现乙烯可以控制果实的成熟衰老，而促进乙烯合成的主要限速酶是ACC合成酶，这个发现成为了改善甜瓜储藏性的理论依据。CRISPR/Cas系统是新一代基因编辑系统，可以用来靶向敲除或敲入目的基因。因此本实验以老汉瓜为实验材料，以甜瓜ACC合成酶基因为基础设计引物，根据CRISPR-Cas9系统构建敲除甜瓜ACC合成酶基因的表达载体，然后通过农杆菌对“老汉瓜”进行遗传转化，从而得到阳性转基因甜瓜T0代，以此为材料进行生理生化检测。主要结果如下：
　　1.以ACS基因序列为基础，设计靶位点，将合成的引物构建到植物基因敲除载体pP1C.4上，获得了敲除甜瓜ACC合成酶基因的表达载体pP1C.4-ACS。
　　2.对甜瓜品种“老汉瓜”的组织培养体系进行了探索和优化，确定了适合的培养体系。通过农杆菌GV3101进行甜瓜的遗传转化，获得了3株T0代的转基因甜瓜苗。
　　3.观察转化前后甜瓜苗的形态变化，发现敲出ACC合成酶基因后，抑制了根部的伸长，并且延缓了植株的生长和黄化。对转基因甜瓜的SOD、POD和CAT的酶活性进行检测，发现这三种酶的活性均高于野生型甜瓜，初步验证了ACC合成酶对植物衰老和对逆境的耐受能力起着重要作用。同时为进一步研究敲除ACC合成酶对甜瓜果实成熟的影响奠定基础。

目录

英文缩略语

第一部分 文献综述

引言

1. 基因组编辑技术

1.1 ZFN技术

1.2 TALEN技术

1.3 CRISPR-CAS9系统

1.4 TALEN、ZFN和 CRISPR/Cas系统的比较

2.乙烯的合成途径及调控作用

2.1 乙烯的生理功能

2.2 乙烯的生物合成途径

2.3 ACC合成酶的调控作用

3.甜瓜的储藏问题

4.研究目的与意义

第二部分 实验部分

第一章 植物表达载体的构建

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.3 结果与分析

1.4 讨论

第二章 ACC合成酶基因的转化及转基因植株检测

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

第三章 转基因植株的形态变化和生理生化检测

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 实验结果

3.4 讨论

第三部分 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间取得的研究成果

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