PI3K/AKT/PTEN/mTOR信号转导通路对胆管癌细胞凋亡抑制作用及化疗增敏作用的研究

摘要

人体的整体功能上的协调统一是通过细胞与细胞间的相互识别、联络和相互作用而实现的，这种存在于细胞内和细胞间的识别、联络和相互作用，又在多个层次上具有交叉调控，形成了一个十分复杂的信号网络系统。我们把细胞接受外界信号，通过一整套特定的机制，将胞外信号转导为胞内信号，最终调节特定基因表达，并引起细胞的应答反应称为细胞信号转导。细胞的种种功能活动受到复杂的信号转导通路的调控，精细调节的信号转导是正常生命活动的前提，而信号转导异常可以导致病理过程。 许多研究表明，如果控制细胞增殖、分化的信息传递通路中某一环节异常，就会引起细胞生长失控，可以导致肿瘤形成或者肿瘤凋亡。在介导肿瘤细胞凋亡的众多信号转导途径中，以PI3-K/Akt/PTEN/mTOR信号转导途径对凋亡的调节作用尤其重要。PI3-K/Akt/PTEN/mTOR信号传导通路活化可以抑制多种刺激诱发的细胞凋亡，促进细胞周期进展，从而促进细胞的生存和增殖，同时参与血管形成，在肿瘤的形成中扮演重要角色，并参与肿瘤的侵袭和转移。而且该信号传导通路还通过诱导肿瘤细胞生存、分化和血管形成，在恶性肿瘤的发生发展和耐药方面发挥重要作用，也因此成为肿瘤干预治疗的新靶点。 胆管癌主要指源于肝外胆管的恶性肿瘤，预后不佳。流行病学少见，国外尸检发现率为0.01％～0.5％，占恶性肿瘤总数的3％，我国尸检占0.07％～0.3％，其检出率逐年增高。而临床上对胆管癌的治疗颇为棘手。进一步探讨PI3-K/Akt/PKB通路的调节以及与其他通路的交联，提高对该通路在胆管癌中的作用的认识，有助于更好地理解其恶性行为，并针对该信号传导通路寻找新的抗肿瘤药物，对于胆管癌的治疗将具有十分重要的意义。 在邹声泉教授的领导下，我们课题组在前期的研究中通过对胆管癌肿瘤生物学特性的研究有了深入的研究，认识到胆管癌中有癌基因k-ras、c-erbB-2和c-myc,抑癌基因PTEN、p53、DPC4/Smad、p15和p16以及凋亡相关基因bcl-2和bax的突变、缺失或过表达，在肝外胆管癌的分子细胞遗传学研究取得了很大的进展，而我们也从前期研究的与胆管癌发生、发展和转移相关的基因出发，结合与肿瘤的形成、凋亡和转移，并在恶性肿瘤的发生发展和耐药方面发挥重要作用的信号转导通路PI3K/AKT/PTEN/mTOR出发，对该信号转导通路在胆管癌的凋亡及对化疗增敏作用做出一些探讨和研究。为肝外胆管癌的诊断和治疗探讨新的理论基础和实验依据。但由于时间的关系，我们的实验尚局限于较浅的层面，在今后的工作中我们将作进一步深入研究。 第一部分：肝外胆管癌mTOR、Akt和PTEN蛋白表达 论文1.肝外胆管癌mTOR、Akt和PTEN的表达及生物学意义 目的 研究PI3K/PTEN/AKT/mTOR信号转导通路中mTOR、Akt和PTEN蛋白在胆管癌中的表达，及其在胆管癌发生，发展中的作用。 结论 1.PTEN较正常对照的胆管组织的高表达是降低的，而mTOR和Akt的表达是升高的； 2.PTEN和Akt、mTOR的关系密切，并呈负性相关，说明了PTEN的失活性，Akt和mTOR的低表达在胆管癌的生长增殖中是有一定作用的，并且有密切的关系。 第二部分：PTEN-PI3K/AKT信号转导通路与mTOR信号转导通路的关系 论文2.体外转染PTEN抑制胆管癌QBC939细胞生长及下调mTOR表达的研究 目的 研究信号转导通路PI3K/AKT/PTEN/mTOR中抑癌基因PTEN体外对胆管癌QBC939细胞生长的抑制作用，及对下游mTOR表达的影响。 结论 1.将携带有绿色荧光蛋白GFP的野生型PTEN导入QBC939细胞中，发现细胞的PTEN蛋白的表达增强，磷酸化AKT的表达明显降低；而转染不具有磷酸酶活性的突变型PTEN的QBC939细胞虽然PTEN的表达也增强，但AKT的表达无明显改变。说明PTEN对肿瘤细胞的调控与脂质酶的磷酸化有密切关系。 2.转染前后肿瘤细胞的凋亡率有显著意义的改变也提示PTEN可使细胞停滞于G1期。 3.转染前后mTOR相应的改变说明，PI3K/AKT/PTEN与mTOR信号转导通路的关系密切。 4.PTEN作为一种重要的抑癌基因对胆管癌细胞体外作用有重要影响，其主要的机制可能是通过PI3K/AKT/PTEN信号转导通路，作用于蛋白转录和翻译有重要调控作用的关键产物mTOR，对其产生直接影响。 论文3.pcDNA3.1-mT0R表达质粒的构建及鉴定 目的 构建人mTOR基因的真核表达质粒pcDNA3.1-mTOR，并进行鉴定。方法 1.用RT-PCR法扩增mTOR的全长cDNA； 2.将空载质粒pcDNA3.1和扩增的mTOR用分别用HindⅢ和BamHI双酶切，玻璃奶回收，纯化，连接； 3.接种于LB培养基中，运用酶切，进行PCR鉴定； 4.DNA测序分析。 结论 通过RT-PCR法扩增mTOR的全长cDNA，将空载质粒PCDNA3.1和扩增的mTOR用分别用HindⅢ和BamHⅠ双酶切，回收，纯化，连接，并运用PCR鉴定，DNA测序分析，构建成功人mTOR基因的真核表达质粒pcDNA3.1-mTOR。 论文4.pcDNA3.1-mTOR质粒体外转染胆管癌细胞 目的 研究信号转导通路mTOR体外对胆管癌QBC939细胞生长的抑制作用，及对抑癌基因PTEN的负反馈调节影响。 结论 1.转染成功后，胆管癌细胞的生长明显增快，说明mTOR的增高可促进胆管癌细胞的生长，为mTOR的特异性的抑制剂的运用提供了证据； 2.用携带有mTOR的质粒转染QBC939细胞后，发现细胞的PTEN蛋白的表达增强；转染前后PTEN的这种明显的改变，说明mTOR可能通过PI3K/AKT/PTEN与mTOR信号转导通路负反馈调节PTEN的表达。 第三部分：rapamycin和LY294002对胆管癌细胞凋亡抑制作用和化疗增敏作用的研究 论文5.磷酸化抑制剂对PI3K/AKT/PTEN/mTOR信号转导通路的作用及对胆管癌化疗增敏作用的研究 目的 运用磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂(phosphatidylinosito13-kinase，PI3-K)LY294002[22(42吗啉基)282苯基24氢212苯并吡喃242酮]作用于胆管癌细胞系QBC939，探讨抑制PI3K/AKT信号转导通路对胆管癌化疗的增敏作用；并探讨PI3K/AKT信号转导通路对胆管癌细胞的凋亡抑制作用。 结论 1.磷酸化抑制剂LY294002能有效的提高化疗药物5-FU，MMC，CELECOXIB体外对QBC939细胞抑制作用的敏感性，通过抑制PI3K/AKT信号转导通路，抑制其激活来增强胆管癌细胞的化疗效果 2.联合运用LY294002胆管癌细胞较单独使用组凋亡率明显增高，说明抑制PI3K介导的信号转导通路对胆管癌细胞的凋亡有抑制作用。 论文6.mTOR特异性抑制剂rapamycin抑制胆管癌细胞生长的研究 目的 运用mTOR特异性抑制剂rapamycin作用于胆管癌细胞系QBC939，探讨抑制PI3K/AKT信号转导通路对胆管癌化疗的增敏作用；同时探讨PI3K/AKT信号转导通路对胆管癌细胞的凋亡抑制作用。 结论 1.mTOR特异性抑制剂rapamycin能有效的提高化疗药物5-FU，MMC，CELECOXIB体外对QBC939细胞抑制作用的敏感性，通过抑制mTOR信号转导通路，抑制其活性来增强胆管癌细胞的化疗效果 2.联合运用rapamycin胆管癌细胞较单独使用组凋亡率明显增高，说明抑制mTOR介导的信号转导通路对胆管癌细胞的凋亡有抑制作用。

目录

前言

第一部分：肝外胆管癌mTOR、Akt和PTEN蛋白表达

第二部分：PTEN-PI3K/AKT信号转导通路与mTOR信号转导通路的关系

第三部分：rapamycin和LY294002对胆管癌细胞凋亡抑制作用和化疗增敏作用的研究

文献综述1mTOP信号传导通路及其生物学功能

文献综述2 PI3K/Akt/PTEN/mTOR信号转导通路在恶性肿瘤发展和治疗中的作用

博士学位期间发表文章目录

致谢