抗肺纤维化新药吡非尼酮的药代动力学研究

摘要

特发性肺纤维化(Idiopathicpulmonaryfibrosis，IPF)为间质性肺疾病(interstitiallungdisease)最为严重的一种表现形式，是以弥漫性肺泡慢性炎症和间质纤维化为主要病理特征的疾病。近年来间质性肺纤维化的发病率呈上升趋势。目前在世界范围内将近有500万人罹患此症，该类患者平均寿命仅为2.8年，每年约40000患者因之而死亡。此病在我国发病率也有明显增加。 吡非尼酮(pirfenidonePF)是一种新型的广谱抗纤维化药物，其结构是5-甲基1-苯基2(1氢)吡啶酮(5methyl-1-phenyl-2(1H)-pyridone)。它能抑制胶原的合成，阻止甚至逆转纤维化发生和瘢痕形成。本品易于为胃肠道所吸收，在体内各组织中分布广泛，可通过血脑屏障。基于本品对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的拮抗作用，有可能被用于多发性硬化症(MS)和类风湿性关节炎(RA)的治疗。作为特发性肺纤维化治疗药物，PF已经被认定为罕用病治疗药物(orphandrug)在美国进行各项开发研究，并根据美国一项名为“EarlyAccessProgram”项目用于一定数量的特发性肺纤维化患者。同时，本品也亦已被日本厚生省指定为“孤儿药物”。2003年，InterMune公司宣布的一项随机双盲多中心Ⅱ期临床研究结果表明，本品治疗特发性肺纤维化比皮质激素泼尼松更为有效。此项研究共入选53例患者，其中，中至重度特发性肺纤维化患者有46例，继发性肺纤维化患者7例。患者每日口服PF40mg·kg-1或泼尼松0.33mg·kg-1。接受治疗12个月后，以最低氧饱和度为考察指标，结果显示本品的治疗效果优于泼尼松；6分钟步行测试结果表明治疗组疗效明显优于泼尼松治疗组(p=0.014)。通过对其它临床终点指标的考察，如用力肺活量(FVC)、步行距离等，本品治疗组也均优于泼尼松组，且具有良好的耐受性。PF的抗纤维化作用已经在多种试验动物纤维化模型中得到证实。在体外实验中发现PF能抑制成纤维细胞的增殖和活性，减少TGF-β的表达。在博莱霉素诱导的鼠肺纤维化模型中发现它能抑制Ⅰ型和Ⅲ型胶原的mRNA的表达，抑制巨噬细胞产生PDGF，减少羟脯氨酸的产生，并能改善肺功能。 第一部分吡非尼酮的药物代谢动力学研究 新药吡非尼酮(Pirfenidone，PF)的主要药效学实验结果显示，该药具有良好的抗肺纤维化作用。吡非尼酮的抗肺纤维化作用在国际上亦得到广泛研究。该药的研究与开发对有效防治肺纤维化病变具有重要意义。本项工作采用SD大鼠及beagle犬进行该药的药代动力学研究工作，揭示其在二种动物体内的处置规律，为该药的进一步临床应用提供依据。 第一节吡非尼酮的药动学特征 第二节吡非尼酮在大鼠体内组织分布研究 大鼠按100mg·kg-1剂量灌胃给予PF后，分别于10、60、150min处死。样品经HPLC法检测组织PF浓度。结果表明，大鼠给药后PF在各组织中均有分布，其中尤以胃肠道及血流丰富的组织，如脾、肝、心、肾、肺等组织中浓度较高。PF在脑中亦有较高分布，说明该药能透过血脑屏障。 第三节吡非尼酮在大鼠体内排泄研究 大鼠灌胃给予PF后，经与空白尿样比较，尿中未发现PF原形，而主要以代谢物M1、M2形式从尿中排泄；经与空白粪便样比较，粪便中仅发现痕量PF原形，该药主要以二种代谢物形式排泄；经与空白胆汁比较，胆汁中亦发现痕量PF原形，亦发现代谢物M1和少量的M2。 初步的试验结果表明，PF主要以代谢物的形式从尿中排泄。另有少量代谢物及痕量的原形从粪便及胆汁中排泄。由于无代谢物对照品，尚未作定量检测。 第四节吡非尼酮血浆蛋白结合率试验 本实验采用平衡透析法研究吡非尼酮血浆蛋白结合率，并进行人和大鼠PF血浆蛋白结合率的比较。用高效液相色谱法测定平衡透析膜两侧的PF药物浓度，透析膜一侧为空白血浆，另外一侧为含PF2mg·L-1、20mg·L-1、100mg·L-1药物浓度的NaH2PO4缓冲液，平衡时间为24小时。在2mg·L-1～100mg·L-1PF浓度范围内，PF人血浆蛋白结合率分别为77.78％、71.67％、66.19％，PF大鼠血浆蛋白结合率分别为64.09％、84.92％、84.27％。 第二部分吡非尼酮对大鼠肝细胞色素P450酶活性的影响 第一节吡非尼酮对大鼠P450酶总酶活性的影响 采用差示光谱法测定微粒体混悬液蛋白中细胞色素P450含量。SD大鼠48只，随机分成空白组、肝药酶诱导剂组、肝药酶抑制剂组，吡非尼酮低剂量组、吡非尼酮中剂量组和吡非尼酮高剂量组。空白组给予1％CMC-Na，诱导剂组地塞米松100mg·kg-1，抑制剂组酮康唑40mg·kg-1，PF低、中、高剂量组分别为PF25mg·kg-1，50mg·kg-1和100mg·kg-1灌胃给药，一日一次，连续6日。取大鼠的肝脏制备肝微粒体，测定肝微粒体中的蛋白浓度，用分光光度计对样品进行比色。结果表明，该药在中剂量组(50mg·kg-1)和高剂量组(100mg·kg-1)的P450含量与空白组比较有显著性差异(P＜0.01)，提示该药在较大剂量时对肝药酶有诱导作用。 第二节吡非尼酮对CYP3A及CYP2E1的影响作用 采用Nash-甲醛形成法(Nash比色法)来研究吡非尼酮对大鼠CYP3A及CYP2E的影响，配制0.5ml反应液，加入NADPH生成系统启动反应，37℃水浴20min后，加入20％ZnSO40.05ml终止反应，混匀后每管再加入饱和Ba(OH)20.05ml，2500g离心15～20min，将0.35ml上清液转移至另一试管中，加入0.15mlNash试剂，混匀后加入50℃水浴温孵30min，冷却后在412nm测定样品光密度值。结果表明，在给药6d和12d后，吡非尼酮对大鼠肝微粒体NDMA酶(反映CYP2E1)的活性影响不显著(P＞0.05)；而吡非尼酮对大鼠肝微粒体ERD酶(反映CYP3A)具有显著的诱导作用(P＜0.01)并有明显的时间依赖性。 第三部分吡非尼酮的代谢产物研究 第一节吡非尼酮的主要代谢产物及代谢途径 用LC-MS/MS法首次检测出大鼠及健康受试者口服PF后，在尿样及胆汁样中存在微量原形及10种代谢产物。其中M1为PF的5位甲基羟基化产物，M2为M1的羟甲基进一步氧化为羧酸的产物，M3、M4为二羟基化产物，M5、M6和M7为在二羟基化产物的基础上，5位羟甲基不稳定，进一步氧化为羧酸的产物，M7、M8和M9为代谢物M1、M2与葡萄糖醛酸结合形成的二相代谢产物。上述代谢物文献中均未见报道。 大鼠口服PF后，在体内迅速代谢，其代谢物分别从胆汁及尿中排除体外，其中尿为主要排泄形式。尿中M2含量最高，为主要的代谢产物，其次为M1。文献报道吡非尼酮在小鼠体内代谢迅速且完全，尿样中未发现母体化合物。本试验亦证明PF在大鼠体内代谢迅速，但尿中仍检测到痕量原形化合物，说明吡非尼酮虽代谢迅速但不完全。 大鼠口服PF后，其原形及代谢物均广泛分布于各组织中。通过对其靶器官肺组织的LC-MS检测，发现准分子离子为m/z202和216的化合物，其质谱图与尿中M1和M2相同，故可推定为PF的醇化产物和羧酸化产物。 健康受试者口服PF后，其原形及代谢物亦主要随尿排泄。尿中代谢物M2含量最高，为主要的代谢产物。在人尿中代谢物M1相对含量低于大鼠，而二相代谢产物的相对含量要高于大鼠。人尿中未检测到准分子离子为m/z232的三个代谢物M5、M6、M7。 根据检测结果可以推断，吡非尼酮在大鼠及健康受试者体内的主要代谢途径为：吡非尼酮吡啶环上的5位甲基先氧化为醇成为PF羟基化产物M1，M1的羟甲基进而氧化为羧酸M2。M1、M2再与葡萄糖醛酸结合后产生二相代谢产物M7、M8和M9而排出体外。其次还产生少量的二羟基化产物M3，M4。 第二节吡非尼酮的主要代谢产物M2的结构确定 20只大鼠灌胃口服PF100mg·kg-1后1h，心室采血，收集血浆，样品经提取后用半制备色谱柱分离，收集M2流份，经减压干燥、醋酸乙酯萃取、适量去离子水洗三次后，减压除去溶剂，用于纯度鉴定及结构鉴定。分离提纯后的吡非尼酮主要代谢产物M2经HPLC纯度鉴定为97.2％。经UV、IR、MS和NMR综合解析，M2的结构确证为PF原型吡啶环上的5位甲基氧化为羧基的羧酸化产物。

目录

摘要

Abbreviations

前言

第一部分吡非尼酮的药物代谢动力学研究:第一节吡非尼酮的药动学特征

第一部分吡非尼酮的药物代谢动力学研究:第二节吡非尼酮在大鼠体内组织分布研究

第一部分吡非尼酮的药物代谢动力学研究:第三节吡非尼酮在大鼠体内的排泄研究

第一部分吡非尼酮的药物代谢动力学研究:第四节吡非尼酮血浆蛋白结合率研究

第二部分吡非尼酮对肝药物代谢酶活性的影响:第一节吡非尼酮对大鼠P450酶总酶活性的影响

第二部分吡非尼酮对肝药物代谢酶活性的影响:第二节吡非尼酮对CYP3A及CYP2E1的影响

第三部分吡非尼酮的代谢物的研究报告:第一节吡非尼酮的主要代谢产物及代谢途径

第三部分吡非尼酮的代谢物的研究报告:第二节吡非尼酮的主要代谢产物M2的结构确定

综述

工作小结

致谢