丙型肝炎病毒核酸国家标准物质的研究

摘要

背景和目的 丙型肝炎病毒核酸(HCVRNA)检测缺乏统一的定量标准，给临床的诊断和治疗带来了很多问题。研制国内用于HCVRNA扩增检测的血清标准物质，推进核酸检测的标准化。构建原核表达系统，表达内含丙型肝炎病毒部分RNA序列的病毒样颗粒，该病毒样颗粒所含的HCV部分核酸序列因被噬菌体衣壳蛋白包裹而具有耐核糖核酸酶(RNase)特性。替代冻干血清的标准品，使其具有更好的临床适用性。 方法 1、选择HCV阳性血浆，用荧光定量PCR检测试剂进行初步检测，再用阴性的献血员血浆，除纤维蛋白原(纤原)后进行稀释。采用国际公认的PCR内标定量方法，即ROCHE公司COBASAMPLICOR及相应试剂进行检测，以WHO标准品(NIBSC编号96/790)进行比对定值。 2、将该定值制备物发放给HCVRNA荧光定量试剂的生产厂家进行检测。 3、由于HCV分型和HCVRNA定量检测试剂盒，所检测的区域主要集中在5'-UTR区，因此本研究拟选用5'-UTR区作为MS2噬菌体的包装序列。引物5'端引入HindⅢ酶切位点。PCR产物进行T载体克隆后用限制性内切酶HindⅢ酶切获得所需要的目的片段，与用HindⅢ酶切的表达载体pNCCL1相连接，构建一新的表达载体pNCCL1-HCV。在IPTG诱导下，衣壳蛋白会在携带有pET-MS2-HCV的细菌中表达，并与reRNA组装成病毒样颗粒。诱导后的细菌经超声碎菌，离心后即可得到含病毒样颗粒的上清。为验证包装的核酸为HCVreRNA，取20μl上清按1∶10至1∶106比例稀释后，依照异硫氰酸胍盐提取RNA的方法提取VLPs的RNA，然后进行RT-PCR。取20μl所得到的上清，加入RNaseA(100U)和DNaseI(20U)，37℃,温育4天以观察病毒样颗粒的稳定性。将病毒样颗粒用PEG6000沉淀后，加入正常人阴性血清，取20μl于45℃放置3天观察病毒样颗粒是否适合运输。 结论 第一部分:研究获得的定值冻干血清是我国第一个用于核酸检测的标准品。由于该标准物质基质为冻干血清，含有完整的病毒核酸序列，与临床检测的病人标本一致，具有很好的临床适用性。推广范围包括各个HCVRNA检测试剂生产厂家、医院临床基因扩增检验实验室及进行核酸筛查的血站等。该标准物质，在国内主要PCR检测试剂的生产厂家均得到了应用，在稳定性及定值的准确性方面得到了充分肯定。由该标准物质传递的血清基质的标准曲线，由于血清基质的标准曲线同待测样本一样经过纯化和逆转录步骤，消除了标准品与样本间提取效率和逆转录效率检测差异，同时消除了不同试剂不同人员操作间的差异，又具有溯源性，使检测结果准确并具有可比性，因此该标准物质在临床基因扩增定量检测HCVRNA方面有广阔的应用前景，将有力的促进临床HBVDNA和HCVRNA定量检测的标准化。 第二部分:研究得到的表达载体pET-MS2-HCV及原核表达系统，可以作为构建和制备耐RNase的HCVRNA标准品和质控品的平台。获得了HCV1b、2a、6a型三种基因型病毒样颗粒。该病毒样颗粒可以直接作为作为冻干血清标准物质的替代品，也可以做HCV核酸测定中的阳性质控物和某些HIVRNA外标定量测定的外标定量标准；还可以为HCVRT-PCR检测试剂盒和实验室室问质量评价提供无生物传染危险性的样本。如果对pET-MS2-HCV中的HCV检测的目的片段进行缺失、插入和突变等修饰，所获得的病毒样颗粒可以作为HCV定量测定中的内标标准和HCVRT-PCR测定的内标质控物。

目录

缩略语说明

摘要

引言

第一部分血清标准物质的研制与应用

第二部分内含HCV部分核酸序列的病毒样颗粒的构建与表达

综述丙型肝炎病毒基因型检测进展

附录攻读博士期间年发表论文目录

致谢