用三个氨基酸的感应器探测mSlo1孔道和β2亚基的相互作用位点

摘要

钙和电压激活的大电导钾离子通道（Maxik 通道，又名BK通道）广泛地存在于可兴奋细胞，特别是神经系统中，具有调节胞内钙浓度和膜电位等重要生理功能。目前，人们对电压依赖的钾离子通道（Kv通道）的研究已较为深刻。BK通道与Kv通道在结构和功能上既存在某些相似之处又有各自的特点。如它们都能结合β辅助亚基，并通过其N端的疏水氨基酸引起N型失活。然而，BK通道的胞内阻断剂（如TEA、QX-314等）却不能像Kv通道那样减慢失活过程。因此，BK通道的a亚基在失活过程中如何与其β亚基的N端相互作用，它们的相互作用位点怎样，这些问题自被提出后至今仍未解决。 我们将hβ2 N端的前三个氨基酸FIW突变为FWI，发现hβ2的突变体hβ2-FWI对α亚基的失活没有影响，但使其的失活恢复时间曲线从单指数转变为双指数特征。利用hβ2-FWI的这一特性，我们将α亚基形成孔道的S6区的疏水性氨基酸依次突变为不太疏水的丙氨酸。S6的突变体与FWI共表达来检测失活过程中hβ2亚基与α亚基孔道的相互作用位点。 本课题的主要研究成果如下： （1）在S6突变中，mSlo1-I323A与hβ2-FWI共表达，它们的失活恢复双指数成分中的慢相得到最大地消减，即能最好拟合成单指数恢复曲线，说明I323是在失活过程中与β2亚基相互作用的主要位点。另外，M314A和V319A的快相变得异常地快，说明这两点也在失活过程中起着一定的作用。根据FWI的线性结构关系，我们推测如下的相互作用关系：I323－I，V319－W，M314－F；I323起着主导性的作用。 （2）虽然V319A对QX-314的敏感性强于其他位点，但QX-314在孔道内并没有特异性的结合位点。我们提出了一个非竞争模型。I323是孔道内的最后一个氨基酸，既β2 N端失活域的作用位置是在孔道口，而QX-314的作用位置位于孔道内，因此QX-314不会影响β2引起的失活过程，这就解释了胞内阻断剂为什么不减慢BK通道的失活。这为进一步了解BK通道的结构和门控机制提供了重要的实验和理论支持。 （3）I323A不管是单通道还是宏观电流都有外向整流现象，而野生型的mSlo1没有；I323A的单通道出现非常像噪声的电流，就像dSlo1A的单通道电流一样。这说明了Ile-323还调节BK通道的门控。在dSlo1A上与之对应的氨基酸是Thr-337。Ile是疏水氨基酸，而Ala和Thr都是亲水氨基酸。我们把野生型mSlo1的Ile-323突变为Thr，发现I323T导致与dSlo相似的噪声单通道电流。这个机制可能帮助我们了解dSlo1A单通道的行为。 （4）计算机模拟mSlo1孔道与β2 N端相互作用的结构，得到了部分可供参考的两蛋白分子共价键之间相互作用的细节。