小鼠胚胎玻璃化冷冻对子代发育影响的初步研究

摘要

本研究分为三部分：
　　 第一部分：研究玻璃化冷冻对小鼠胚胎体内外发育潜能的影响
　　 目的：
　　 观察新鲜6～8-细胞胚胎和玻璃化冷冻复苏6～8-细胞胚胎在囊胚形成率、囊胚孵出率及妊娠率、小鼠出生率的差异，初步探讨玻璃化冷冻对胚胎体内外发育潜能的影响。
　　 方法：
　　 共取性成熟期雌鼠（大于6～7周龄）200只。同笼雌鼠于见阴栓后20小时脱颈处死，取2-细胞胚胎。取胚后36小时左右观察胚胎，将6～8细胞胚胎分为两组，一组新鲜胚胎进行移植（新鲜移植组），一组进行玻璃化冷冻（玻璃化冷冻组）2周后复苏移植。
　　 两组各取50枚移植前胚胎，体外培养48～72小时，观察两组胚胎体外培养发育至囊胚、及囊胚孵出的情况。
　　 复苏后的6～8-细胞胚胎经1～3 h培养，选择外形正常的胚胎移植于假孕63～67 h的受体母鼠的两侧子宫中，每侧8枚。新鲜移植组为新鲜6～8-细胞胚胎移植。妊娠17～20 d自然分娩后记录产仔数。对两组妊娠率、小鼠出生率进行比较。
　　 结果：
　　 1. 新鲜移植组和玻璃化冷冻组胚胎一般情况观察：新鲜移植组共获823枚6～8细胞优质胚胎。玻璃化冷冻组共获1156枚6～8细胞优质胚胎，冷冻1143枚胚胎，复苏后存活胚胎为884枚。复苏成活率为77.34%。
　　 2. 新鲜移植组和玻璃化冷冻组胚胎囊胚形成率、囊胚孵出率的比较：两组各取50枚移植前胚胎，体外培养观察，新鲜移植组形成囊胚46枚，囊胚形成率为92%；孵出囊胚42枚，囊胚孵出率为84%。玻璃化冷冻组形成囊胚45枚，囊胚形成率为90%；孵出囊胚43枚，囊胚孵出率为86%。两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　 3. 新鲜移植组和玻璃化冷冻组妊娠率的比较：新鲜移植组移植假孕鼠47只，妊娠23只，妊娠率为48.93%；玻璃化冷冻组移植假孕鼠51只，妊娠24只，妊娠率为47.06%。两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　 4. 新鲜移植组和玻璃化冷冻组仔鼠出生率的比较：新鲜移植组共移植胚胎752枚，分娩子代99只，出生率为13.16%；玻璃化冷冻组共移植胚胎816枚，分娩子代103只，出生率为12.62%。两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　 结论：
　　 玻璃化冷冻复苏后，成活胚胎囊胚形成率、囊胚孵出率及移植后的妊娠率，仔鼠出生率，与新鲜胚胎相比无明显差异。说明玻璃化冷冻对胚胎体内外发育潜能无明显影响。
　　 第二部分：研究玻璃化冷冻对子代一般发育情况的影响
　　 目的：
　　 对新鲜移植组和玻璃化冷冻组子代小鼠的生理发育、运动协调功能、器官畸形发病率进行观察，进一步探讨胚胎玻璃化冷冻对子代发育的影响。
　　 方法：
　　 1. 仔鼠出生当天定为出生后0d。记录新生小鼠体重，仔鼠耳廓分离、上下牙萌出、张耳、睁眼、睾丸下降、阴道开口、全身绒毛、全身白毛等生理发育指标；平面翻正、前肢悬挂、爬行、空中翻正等神经反射和运动协调功能指标。
　　 2.两组均于出生后第3天，第7天，第14天，第21天，第28天，第60天分别取雌雄小鼠各6只，脱颈处死，解剖后观察各器官发育情况。
　　 3.两组均于上述时间段分别取小鼠子宫、卵巢、睾丸，4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，行HE染色。进一步观察小鼠生殖器官发育过程中的形态学变化，每个时间段雌雄小鼠各6只。
　　 结果：
　　 1.生长发育：两组新生仔鼠平均体重分别为1.42±0.26g，1.39±0.38g。两组小鼠生理发育和运动协调指标测试结果提示两组小鼠发育无明显异常。
　　 2.大体解剖：玻璃化冷冻组共出生103只仔鼠，其中雄鼠58只。有一只子代解剖后可见雄性生殖器官发育正常，但副中肾管无完全退化，呈白色羊角样。该鼠染色体分析为40，XY。故认为是雄性畸形，畸变原因未知。余器官未见明显畸形。新鲜移植组共出生99只仔鼠，其中雄鼠56只，各器官均未见明显畸形。
　　 3.生殖器官形态学观察：两组小鼠在上述相应时期，子宫、卵巢、睾丸发育中均未见明显形态学异常。
　　 结论：
　　 玻璃化冷冻不影响小鼠的生理及运动协调能力的发育。但对出现的小鼠生殖管道畸形的原因，需要进一步研究。
　　 第三部分：研究玻璃化冷冻对雌性子代子宫发育的影响
　　 目的：
　　 通过比较两组子代子宫发育过程中，Wnt4、Wnt5a、Wnt7a、β-catinin、Hoxa10基因的表达，进一步研究玻璃化冷冻复苏过程对雌性小鼠子宫形态和功能的影响。
　　 方法：
　　 1. 两组均于生后第3天，第7天，第14天，第21天，第28天，第60天取雌性小鼠各6只，分别取其子宫。取其中3只，左侧子宫固定行免疫组化，右侧行PCR，另3只欲行Western-blot。
　　 2. 用于免疫组化的子宫固定，石蜡包埋，水平横切面切成4μm切片，行Wnt4、Wnt5a、Wnt7a、β-catinin、Hoxa10基因蛋白免疫组化染色。
　　 3. 两组上述不同时间段的小鼠子宫，PCR及Western-blot进一步研究Wnt4、Wnt5a、Wnt7a、β-catinin、Hoxa10基因、蛋白在子代子宫发育过程中的表达变化。
　　 结果：
　　 1. 免疫组化结果：
　　 Wnt4表达仅限于腔上皮和邻近子宫腺体之间的基质。Wnt5a在基质内呈强表达，在腔上皮和腺上皮内弱表达。Wnt7a在腔上皮和腺上皮内表达。Β-catenin在子宫内膜上皮及基质内均有表达。Hoxa10主要在基质及子宫肌层内表达。对Wnt4、Wnt5a、Wnt7a、β-catenin和Hoxa10 在两组相应时期的免疫反应性进行统计学分析，两组相应时期的平均密度值无明显差异(P＞0.05)。
　　 2. RT-PCR结果
　　 RT-PCR结果显示:Wnt4、Wnt5a、Wnt7a、Hoxa10、β-catenin在两组子代子宫发育过程中均有表达，在上述相应时期表达无明显差异 (P＞0.05)。
　　 3. Western-blot结果
　　 Western-blot结果显示：Wnt4、Wnt5a、Wnt7a、Hoxa10、β-catenin 在两组子代子宫发育过程中均有表达，在上述相应时期表达无明显差异(P＞0.05)。
　　 结论：玻璃化冷冻不影响出生后小鼠子代子宫的发育和功能。