单表位特异性同种CTL的最佳刺激途径及建立HLA-G/IgG二聚体的昆虫表达系统

摘要

文章从以下两部分就单表位特异性同种CTL的最佳刺激途径及建立HLA-G/IgG二聚体的昆虫表达系统进行了综述。
　　第一部分：单表位特异性同种CTL的最佳刺激途径
　　随着移植物抗白血病反应(GVLR)[1,2]和移植物抗肿瘤反应(GVTR)[3,4]研究的深入,同种反应性 T细胞被认为在清除恶性肿瘤中具有巨大的潜力。所谓同种反应性T细胞,它是指由于供者与受者MHC型别不同,普通肽段与MHC分子结合,形成了外来的pMHC分子(相对受者而言),激活了一群特异性的T细胞即同种反应性T细胞[5]。同种反应性T细胞的识别具有pMHC特异性。而移植物中一般含有多种pMHC分子,其刺激出的同种反应性T细胞为针对多种细胞表位的毒性T细胞(CTL),对正常细胞也有杀伤作用。所以很有必要建立一种能高效制备单一表位特异性同种CTL的方法。
　　本实验室课题《过继单一pMHC特异性的同种CTL清除体内特定性状的靶细胞》,其初步结果显示现有实验方法所诱导出的同种CTL在过继小鼠后对特定靶细胞有一定的杀伤作用,但其杀伤力度仍然不够理想,原因极有可能是过继的同种 CTL细胞数量不足、活性不够高。为了使该套过继免疫试验体系能最大限度地呈现出同种CTL的杀伤能力,很有必要对具体的刺激途径进行优化。
　　本文的目的是探索能够诱导出数量最多、质量最好之同种CTL的方法。通过三种不同的注射途径给小鼠注射相同数量的加载二聚体的巨噬细胞,从小鼠体内分离出淋巴细胞,比较获得的同种 T细胞的功能。选择的指标是培养上清中IFN-γ的含量[6,7],含量越高则表明刺激出的同种T细胞活性更强。
　　研究结果表明,皮下注射途径刺激出的同种 T细胞活性更强,体内刺激之后再进行体外刺激效果增加不明显。收集刺激好的同种 T细胞,一次性过继给小鼠,发现其杀伤能力仍不理想,说明需改进的地方仍然很多,有待进一步的研究。
　　第二部分：杆状病毒表达系统产HLA-G/IgG二聚体
　　HLA-G属于非经典的HLAⅠ类分子,已有大量的科学证据表明它可以通过与抑制性受体结合,在体内发挥一系列诱导免疫耐受的作用[14,15]。在本实验室,我们把HLA-G做成二聚体,前期工作也证实我们构建表达的HLA-G/IgG二聚体在体外能够抑制同种 T细胞应答[16],这给我们的启示是,我们所用的HLA-G/IgG二聚体在抑制器官移植排斥反应方面可能具有临床应用价值,同时HLA-G/IgG二聚体在小鼠体内的抑制作用试验正在进行中。
　　本实验室之前生产 HLA-G/IgG二聚体的方法是用载有目的基因的pcDNA3.1质粒转染721.221细胞系,从细胞培养上清中分离纯化出HLA-G/IgG二聚体。考虑到721.221细胞系生产的生物制品很难通过国家食品药品管理局(FDA)认证,而杆状病毒表达系统早已被认为是一种安全且产量高的表达系统[17]。所以本研究的目的是证明HLA-G/IgG二聚体能够在杆状病毒表达系统中以较高产量表达,为后续的应用打下基础。

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英文缩略词表

第一部分：单表位特异性同种CTL的最佳刺激途径

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前言

一、材料与试剂

1、 小鼠

2、 主要试剂

3、 6%淀粉肉汤：

4、 不完全Grace?s培养基：

5、 抗原肽：InsB7-15(CGSHLVEAL)，为小鼠胰岛β细胞来源的自身抗原肽，具有H-2Kb限制性[10]。

6、 ELISA检测IFN-γ试剂盒，购于eBioscience，Catalog Number：88-7314。

7、 仪器设备

二、方法

1. H-2Kb二聚体的获得

2． H-2Kb二聚体的体外折叠复性

3． 加载InsB/H-2Kb二聚体到C3H腹腔巨噬细胞表面

4. 三种不同注射途径刺激同种CTL的产生

5. 同种CTL过继给B6C3F1小鼠

三、结果

1. 用小鼠IgG抗体进行夹心ELISA检测证实所收集的上清中含有可溶性H-2Kb二聚体。

2. 体外复性后的二聚体加载到 C3H 小鼠腹腔巨噬细胞上这后，用抗 H-2Kb构象抗体孵育，流式细胞仪检测。在巨噬细胞表面能检测到H-2Kb分子。这说明纯化之后进行体外折叠复性的HLA二聚体具有正确的构象。

3. 不同注射途径刺激小鼠所获得的淋巴细胞培养上清中IFN-γ的含量及含量与时间的关系曲线。

4. 同种CTL过继给B6C3F1小鼠

四、讨论

第二部分：杆状病毒表达系统产HLA-G/IgG二聚体

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英文摘要

前言

杆状病毒表达系统产HLA-G/IgG二聚体

一、 材料与设备

二、 方法：

三、 结果

四、 讨论

参考文献

综述

参考文献

致谢