血管平滑肌细胞凋亡诱导产生SDF-1α促进移植物动脉硬化

摘要

目的:移植物动脉硬化是以弥漫性内膜增生为特征的慢性血管增殖性疾病,也是导致远期移植器官功能丧失、限制其远期疗效的主要原因。移植物动脉中膜平滑肌细胞凋亡是器官移植后的早期事件,有研究提示移植物动脉中膜平滑肌细胞凋亡可能通过募集骨髓间充质干细胞参与移植物动脉硬化。本研究拟探讨移植物动脉中膜平滑肌细胞凋亡对移植物动脉硬化的促进作用及其分子机制。方法:原代培养大鼠血管平滑肌细胞,构建并转染携带 SM-22α启动子的野生型 p53基因慢病毒载体,采用DAPI细胞核染色和流式细胞术检测过表达 p53对血管平滑肌细胞凋亡的诱导作用,采用Western blot和ELISA分析检测观察血管平滑肌细胞凋亡对细胞因子 SDF-1α,TGF-β和PDGF-BB表达的影响。体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,制备 p53过表达血管平滑肌细胞条件培养液,采用Transwell细胞迁移分析和BrdU标记法检测血管平滑肌细胞凋亡对骨髓间充质干细胞迁移和增殖的影响;并应用选择性细胞信号阻断剂对骨髓间充质干细胞进行预处理,以探讨血管平滑肌细胞凋亡诱导骨髓间充质干细胞迁移和增殖的分子机制。建立大鼠主动脉移植模型,构建并转染携带 SM-22α启动子的BclxL基因慢病毒载体,采用TUNEL分析检测移植动脉中膜平滑肌细胞凋亡情况;采用免疫组化染色检测移植动脉壁中SDF-1α的蛋白水平;采用HE和Masson染色进行组织病理学分析,探讨 BclxL基因转染对移植动脉新生内膜形成的影响;并应用免疫双荧光染色探讨 BclxL基因转染对骨髓间充质干细胞参与内膜增生的影响。同时,建立异系大鼠主动脉移植模型,对受体大鼠分别给予 mTOR抑制剂 rapamycin和MAPK/ERK抑制剂 PD98059治疗,检测其对移植动脉新生内膜形成的影响,以探讨PI3K/Akt/mTOR和MAPK/ERK信号通路在移植物动脉硬化中的作用。结果:慢病毒介导 p53过表达有效诱导血管平滑肌细胞凋亡,凋亡血管平滑肌细胞释放趋化因子SDF-1α,并诱导周围血管平滑肌细胞表达 SDF-1α,引起 p53过表达血管平滑肌细胞培养液中SDF-1α水平明显升高。血管平滑肌细胞凋亡可诱导骨髓间充质干细胞的迁移和增殖,以 SDF-1α中和抗体可阻断该作用。Western blot分析显示血管平滑肌细胞凋亡活化骨髓间充质干细胞的PI3K/Akt/mTOR和MAPK/ERK信号通路,且该作用是由 SDF-1α介导。用PI3K/Akt/mTOR抑制剂 Ly294002和rapamycin或 MAPK/ERK抑制剂 PD98059对骨髓间充质干细胞进行预处理,可有效阻断血管平滑肌细胞凋亡诱导的骨髓间充质干细胞迁移和增殖。与同系移植相比,异系移植动脉中膜平滑肌细胞大量凋亡,SDF-1α蛋白水平明显升高,8周后异系移植动脉新生内膜形成并伴有新生内膜细胞 PI3K/Akt/mTOR和MAPK/ERK信号通路的活化。慢病毒介导转染 BclxL基因,在 SM-22α启动子调控下目的基因选择性在移植动脉中膜平滑肌细胞高表达,使中膜平滑肌细胞凋亡明显减少,移植动脉中膜 SDF-1α的表达下调及其在血清中的含量下降;并且,伴随早期移植动脉中膜平滑肌细胞凋亡抑制,8周后异系移植动脉新生内膜中CD90和CD105双阳性细胞的数量明显减少,且血管新生内膜面积和管腔狭窄程度均显著减少。同样,rapamycin和PD98059均能有效减少骨髓间充质干细胞募集至新生内膜以及移植动脉硬化。结论:移植动脉中膜平滑肌细胞凋亡通过产生SDF-1α募集骨髓间充质干细胞,从而在移植物动脉硬化的发生发展中发挥关键作用。PI3K/Akt/mTOR和MAPK/ERK信号传导通路活化是血管平滑肌细胞凋亡诱导骨髓间充质干细胞迁移和增殖的分子机制。以血管平滑肌细胞凋亡为干预靶点将是防治移植物动脉硬化的一个有效策略。
　　本文主要从以下几个部分展开论述：
　　第一部分血管平滑肌细胞凋亡通过诱导产生 SDF-1α促进骨髓间充质干细胞迁移和增殖
　　目的:移植物动脉硬化是以弥漫性内膜增生为特征的慢性血管增殖性疾病。研究提示移植物动脉中膜平滑肌细胞凋亡可能通过募集骨髓间充质干细胞参与移植物动脉硬化。本研究拟探讨血管平滑肌细胞凋亡对骨髓间充质干细胞移植物动脉体外迁移和增殖的影响及其分子机制。方法:原代培养大鼠血管平滑肌细胞,构建并转染携带 SM-22α启动子的野生型 p53基因慢病毒载体,采用DAPI细胞核染色和流式细胞术检测过表达 p53对血管平滑肌细胞凋亡的诱导作用,采用Western blot和ELISA分析检测观察血管平滑肌细胞凋亡对细胞因子 SDF-1α,TGF-β和PDGF-BB表达的影响。体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,制备 p53过表达血管平滑肌细胞条件培养液,采用Transwell细胞迁移分析和BrdU标记法检测血管平滑肌细胞凋亡对骨髓间充质干细胞迁移和增殖的影响;并应用选择性细胞信号阻断剂对骨髓间充质干细胞进行预处理,以探讨血管平滑肌细胞凋亡诱导骨髓间充质干细胞迁移和增殖的分子机制。结果:慢病毒介导 p53过表达有效诱导血管平滑肌细胞凋亡,凋亡血管平滑肌细胞释放趋化因子 SDF-1α,并诱导周围血管平滑肌细胞表达 SDF-1α,引起 p53过表达血管平滑肌细胞培养液中SDF-1α水平明显升高。血管平滑肌细胞凋亡可诱导骨髓间充质干细胞的迁移和增殖,以 SDF-1α中和抗体可阻断该作用。Western blot分析显示血管平滑肌细胞凋亡活化骨髓间充质干细胞的PI3K/Akt/mTOR和MAPK/ERK信号通路,且该作用是由 SDF-1α介导。用PI3K/Akt/mTOR抑制剂 Ly294002和rapamycin或 MAPK/ERK抑制剂 PD98059对骨髓间充质干细胞进行预处理,可有效阻断血管平滑肌细胞凋亡诱导的骨髓间充质干细胞迁移和增殖。结论:血管平滑肌细胞凋亡通过产生 SDF-1α诱导骨髓间充质干细胞的迁移和增殖,而PI3K/Akt/mTOR和MAPK/ERK信号传导通路活化是血管平滑肌细胞凋亡诱导骨髓间充质干细胞迁移和增殖的分子机制。
　　第二部分 移植物动脉中膜平滑肌细胞凋亡募集骨髓间充质干细胞促进移植物动脉硬化
　　目的:移植物动脉中膜平滑肌细胞凋亡是器官移植后的早期事件,但在移植物动脉硬化发生发展中的作用及其机制均不清楚。本研究拟探讨移植物动脉中膜平滑肌细胞凋亡对移植物动脉硬化的促进作用及其分子机制。方法:建立大鼠主动脉移植模型,构建并转染携带 SM-22α启动子的BclxL基因慢病毒载体,采用TUNEL分析检测移植动脉中膜平滑肌细胞凋亡情况;采用免疫组化染色检测移植动脉壁中SDF-1α的蛋白水平;采用HE和Masson染色进行组织病理学分析,探讨 BclxL基因转染对移植动脉新生内膜形成的影响;并应用免疫双荧光染色探讨 BclxL基因转染对骨髓间充质干细胞参与内膜增生的影响。同时,建立异系大鼠主动脉移植模型,对受体大鼠分别给予 mTOR抑制剂 rapamycin和MAPK/ERK抑制剂 PD98059治疗,检测其对移植动脉新生内膜形成的影响,以探讨 PI3K/Akt/mTOR和MAPK/ERK信号通路在移植物动脉硬化中的作用。结果:与同系移植相比,异系移植动脉中膜平滑肌细胞大量凋亡,SDF-1α蛋白水平明显升高,8周后异系移植动脉新生内膜形成并伴有新生内膜细胞 PI3K/Akt/mTOR和MAPK/ERK信号通路的活化。慢病毒介导转染 BclxL基因,在 SM-22α启动子调控下目的基因选择性在移植动脉中膜平滑肌细胞高表达,使中膜平滑肌细胞凋亡明显减少,移植动脉中膜 SDF-1α的表达下调及其在血清中的含量下降;并且,伴随早期移植动脉中膜平滑肌细胞凋亡抑制,8周后异系移植动脉新生内膜中CD90和CD105双阳性细胞的数量明显减少,且血管新生内膜面积和管腔狭窄程度均显著减少。同样,rapamycin和PD98059均能有效减少骨髓间充质干细胞募集至新生内膜以及移植动脉硬化。结论:移植动脉中膜平滑肌细胞凋亡通过产生SDF-1α募集骨髓间充质干细胞,从而在移植物动脉硬化的发生发展中发挥关键作用。以血管平滑肌细胞凋亡为干预靶点将是防治移植物动脉硬化的一个有效策略。

目录

封面

声明

目录

英文缩略词表

中文摘要

英文摘要

绪 论

研究内容

研究目标

技术路线

参考文献

第一部分 血管平滑肌细胞凋亡通过诱导产生SDF-1α促进骨髓间充质干细胞迁移和增殖

中文摘要

英文摘要

材料和方法

结 果

附：实验结果图表

讨 论

参考文献

第二部分 移植物动脉中膜平滑肌细胞凋亡募集骨髓间充质干细胞促进移植物动脉硬化

中文摘要

英文摘要

材料和方法

结 果

附：实验结果图表

讨 论

参考文献

结 论

综 述 血管平滑肌细胞凋亡与骨髓干细胞在移植物动脉硬化中的作用

移植物动脉硬化的病理特点

移植物动脉平滑肌细胞凋亡

血管细胞凋亡的调节：Bcl和p53

移植物动脉硬化新生内膜平滑肌细胞的来源

移植物动脉硬化新生内膜的干细胞来源

SDF-1α募集祖细胞参与血管重塑

趋化因子活化的信号通路介导细胞迁移

小 结

参考文献

致谢

附录1 攻读学位期间发表论文目录