三型肿瘤坏死因子alpha条件性表达载体的构建及其表达

摘要

肿瘤坏死因子α(Tumour necrosis factor alpha,TNF-α)是一种具有多样生物学功能的细胞因子,其以26kD跨膜形式表达在细胞表面,称跨膜型TNF-α(transmembrane TNF-α,tmTNF-α)。tmTNF-α经TNF-α转化酶(TNF-α converting enzyme,TACE)剪切,释放其胞外段而成为17kD分泌型TNF-α(secretory TNF-α,sTNF-α)。本实验室前期研究证实tmTNF-α与sTNF-α在炎症中起着不同的作用,sTNF-α主要通过TNFR1发挥促炎作用,而tmTNF-α可能主要通过TNFR2发挥抑炎作用。
　　为了更加深入的研究两型TNF-α在非可控性炎症恶性转化为肿瘤过程中所起的所用及其机制,我们构建了野生型、跨膜型和分泌型TNF-α条件性表达载体,进行体外表达并用以制备转基因小鼠,为后续研究打下基础。
　　主要结果如下:
　　1.构建三型TNF-α条件性表达载体:
　　通过分子生物学的方法将野生型wtTNF-α、跨膜型tmTNF-α和分泌型sTNF-αcDNA片段插入到条件性表达载体pBSA-IRES-GFP中,经测序等方法证实成功构建pBSA-wttnf-IRES-GFP,pBSA-tmtnf-IRES-GFP,pBSA-stnf-IRES-GFP三种TNF-α条件性表达载体。
　　2.构建CRE真核表达载体:
　　为验证三型TNF-α条件性表达载体的真核表达,构建CRE真核表达载体。利用PCR从CMV-CRE转基因小鼠基因组DNA中钓取CREDNA片段,并将之插入到真核表达载体pcDNA3.1中,经测序等方法证实成功构建pcDNA-CRE真核表达载体。
　　3.体外条件性表达三型TNF-α:
　　将pcDNA-CRE分别与上述三种TNF-α条件性表达载体共转染,通过流式细胞术证实pBSA-wttnf-IRES-GFP或pBSA-tmtnf-IRES-GFP共转染细胞表达tmTNF-α明显高于pBSA-stnf-IRES-GFP共转染细胞;并且三种共转染组均较高表达绿色荧光。而单转染pBSA-wttnf-IRES-GFP、pBSA-tmtnf-IRES-GFP、pBSA-stnf-IRES-GFP及pcDNA-CRE的细胞未检测到tmTNF-α及绿色荧光表达。此外,用ELISA证实pBSA-wttnf-IRES-GFP或pBSA-stnf-IRES-GFP共转染细胞分泌sTNF-α明显高于pBSA-tmtnf-IRES-GFP共转染细胞,提示野生型TNF-α基因表达两型TNF-α,跨膜型TNF-α突变体仅表达tmTNF-α,分泌型TNF-α突变体则仅表达sTNF-α。
　　4.MTT证实sTNF-α的杀伤效应:
　　利用MTT分别检测CRE与上述三型TNF共转染细胞上清对L929细胞的杀伤效应。结果显示pBSA-wttnf-IRES-GFP或pBSA-stnf-IRES-GFP共转染细胞上清的杀伤率明显高于pBSA-tmtnf-IRES-GFP共转染组,并且其杀伤作用能被TNF-α特异性抗体所封闭。而单转染pBSA-wttnf-IRES-GFP、pBSA-tmtnf-IRES-GFP、pBSA-stnf-IRES-GFP及pcDNA-CRE细胞上清对L929细胞几乎无杀伤作用。
　　5.MTT证实tmTNF-α的杀伤效应:
　　用MTT分别检测CRE与上述三型TNF共转染细胞,观察这些效应细胞对L929细胞的杀伤效应。结果显示pBSA-wttnf-IRES-GFP或pBSA-tmtnf-IRES-GFP共转染细胞对L929细胞杀伤率明显高于pBSA-stnf-IRES-GFP共转染细胞,且其杀伤活性能被TNF-α特异性抗体所封闭。但单转染pBSA-wttnf-IRES-GFP、pBSA-tmtnf-IRES-GFP、pBSA-stnf-IRES-GFP及pcDNA-CRE细胞对L929细胞无明显胞毒效应。
　　6.获得野生型TNF转基因小鼠:
　　将构建成功的质粒委托给广州赛业公司,经过基因组PCR验证表明已成功制备野生型TNF转基因小鼠。将转基因小鼠与全身广泛表达CRE的CMV-CRE转基因小鼠交配,2窝共获F1代14只,经基因组PCR证实其中4只小鼠获得TNF基因,但CRE基因阴性;8只小鼠获得CRE基因,但TNF基因阴性;其余2只小鼠则为双阴性,尚未获得双基因阳性小鼠。另外两个品系(pBSA-tmtnf-IRES-GFP,pBSA-stnf-IRES-GFP)转基因小鼠正在制备中。
　　本研究结果为深入研究两型TNF-α在非可控性炎症疾病恶性转化及其它疾病中的作用提供了转基因实验动物模型。

目录

封面

声明

目录

中文摘要

英文摘要

前言

材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

结果

一、三型TNF-α基因CRE-LoxP系统的表达载体构建

（一）pBSA-wttnf-IRES-GFP质粒构建

（二）pBSA-tmtnf-IRES-GFP质粒构建

（三）pBSA-stnf-IRES-GFP质粒构建

五、pcDNA-CRE质粒构建

二、三型TNF-LoxP重组载体体外表达及其生物学活性检测

三、三型TNF转基因小鼠鉴定

讨论

小结

本文创新点

参考文献

致谢