线粒体脱乙酰化酶Sirt3在D-半乳糖诱导的听皮层早衰中的作用及其机制研究

摘要

本文分三个部分进行探讨：
　　第一部分：D-半乳糖诱导的拟老化模型的建立
　　目的:建立D-半乳糖诱导的拟老化模型。
　　方法:2月龄Sprague Dawley(SD)雌性大鼠48只随机分为两组：其中D-半乳糖组给予D-半乳糖500mg/kg/d,颈背部皮下注射，连续8周；另一组为对照组（自然老化组），给予等体积生理盐水，连续8周。造模结束后，每个组分为三个亚组：4月龄组（造模结束后0个月）、10月龄组（造模结束后6个月）和18个月组（造模结束后14个月）。造模结束后，每只大鼠检测听性脑干反应（ABR）；透射电镜下观察听皮层神经元细胞超微结构的退行性变化；甲苯胺蓝染色观察听皮层神经元细胞数目变化；原位末端标记法（TUNEL）检测听皮层细胞凋亡。
　　结果：10月龄和18月龄D-半乳糖组与自然老化组相比，32 kHz听阈显著提高（P<0.05）。透射电镜观察显示，同龄的D-半乳糖组与自然老化组大鼠相比，细胞核变形、染色质固缩、脂褐素沉积、线粒体肿胀、神经纤维脱髓鞘样变等细胞衰老的超微结构病理变化出现时间更早且退行性变更为显著。神经元染色显示，D-半乳糖组大鼠听皮层神经元与同龄自然老化组相比密度降低，18月龄差异有统计学意义（P<0.05）。TUNEL检测表明，D-半乳糖组大鼠听皮层细胞凋亡数目与同年龄的自然老化大鼠相比，10和18月龄细胞凋亡数目显著增加（P<0.01）。
　　结论：随着年龄的增长，听皮层神经元细胞超微结构退行性变明显、神经元密度下降、凋亡数目增多；D-半乳糖加速了听皮层细胞衰老的发展，促进了老年性聋的发生。
　　第二部分：端粒、端粒酶与听觉老化的相关性研究
　　目的：探讨端粒、端粒酶与听觉老化的相关性。
　　方法：2月龄SD雌性大鼠72只随机分为两组：D-半乳糖组给予D-半乳糖500mg/kg/d,颈背部皮下注射，连续8周；对照组给予等体积生理盐水，连续8周。造模结束后，每个组分为三个亚组：4月龄组（造模结束后0个月）、10月龄组（造模结束后6个月）和18个月组（造模结束后14个月）。通过分光光度计比色法检测血清ROS水平；RT-PCR检测听皮层端粒长度及端粒酶TERT mRNA的表达；western blotting检测听皮层端粒酶蛋白表达水平。
　　结果：自然老化组中，随着年龄增长，ROS水平增加；端粒长度变短；端粒酶活性下降。与同龄的自然老化大鼠相比，D-半乳糖组中H2O2和MDA水平升高，而T-SOD活性降低；D-半乳糖组中大鼠听皮层端粒长度在18月龄时缩短有显著差异（P<0.05）；D-半乳糖组中大鼠听皮层细胞4月龄、10月龄和18月龄TERT mRNA表达下降均有显著变化（P<0.05）；D-半乳糖组中听皮层端粒酶TERT在10月龄和18月龄蛋白表达下降有显著差异（P<0.01）。
　　结论：随着年龄的增长，端粒长度变短、端粒酶表达减少。D-半乳糖诱导的拟老化模型加速端粒长度的缩短及端粒酶活性的下降，即加速衰老。
　　第三部分：探讨线粒体脱乙酰化酶Sirt3在D-半乳糖诱导的听皮层早衰中的作用
　　目的：探讨Sirt3在D-半乳糖诱导的听皮层功能障碍中的可能的作用机制。
　　方法：2月龄SD雌性大鼠144只随机分为两组：D-半乳糖组给予D-半乳糖500mg/kg/d,颈背部皮下注射，连续8周；对照组给予等体积生理盐水，连续8周。造模结束后，每个组分为三个亚组：4月龄组（造模结束后0个月）、10月龄组（造模结束后6个月）和18个月组（造模结束后14个月）。分光光度计比色法检测中枢听皮层MDA含量和SOD2活性；Taqman探针法实时荧光定量PCR技术检测听皮层mtDNA4834 bp的缺失率；RT-PCR检测Sirt3和SOD2 mRNA表达；western blotting和免疫共沉淀检测Sirt3和SOD2蛋白表达及SOD2乙酰化水平；免疫荧光检测Sirt3在听皮层的定位表达。
　　结果：与自然老化组相比，4月龄，10月龄和18月龄D-半乳糖组中MDA水平分别升高1.18倍,1.39倍(P<0.05)和1.32倍(P<0.05)，SOD2活性分别下降1.21倍,1.36倍(P<0.05)和4.50倍(P<0.01)；CD水平分别升高1.51倍,1.87倍和1.90倍(P<0.01)；Sirt3 mRNA表达分别下降1.32倍（P<0.05）,1.70倍（P<0.01）和4.46倍（P<0.01）；SOD2 mRNA表达分别下降1.06倍,1.11倍（P>0.05）和2.04倍（P<0.01）； Sirt3的蛋白表达分别下降1.46倍,2.10倍和3.47倍（P<0.01），SOD2蛋白水平降低1.03倍,1.10倍（P>0.05）和2.27倍（P<0.05）；SOD2乙酰化水平升高2.70倍,3.09倍和3.31倍（P<0.01）。
　　结论：D-半乳糖诱导的拟老化听皮层中Sirt3表达下降，使其脱乙酰化SOD2的能力降低，导致SOD2抗氧化活性下降，ROS产生增多，氧化应激出现。氧化应激在听皮层细胞中蓄积，mtDNA受到氧化损伤，发生缺失突变，导致线粒体功能障碍，引起细胞超微结构异常，听皮层细胞凋亡，最终导致老年性聋的发生。

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英文缩略词表

中文摘要

英文摘要

前言

参考文献

第一部分D-半乳糖诱导的拟老化模型的建立

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 端粒、端粒酶与听觉老化的相关性研究

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第三部分 探讨线粒体脱乙酰化酶Sirt3在D-半乳糖诱导的听皮层早衰中的作用

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

综述一

参考文献

综述二

参考文献

附录

致谢