线粒体抗氧化酶Trx2在D-半乳糖诱导的听皮层早衰中的作用及其机制研究

摘要

第一部分 D-半乳糖诱导的听皮层拟老化大鼠模型的建立
　　目的:D-半乳糖诱导的Sprague-Dawley（SD）大鼠听皮层拟老化模型的建立。方法:2个月龄SD雄性大鼠162只，随机分为对照组和拟老化组：其中拟老化组大鼠给予颈背部皮下注射500mg/kg/d的D-半乳糖，连续8周；对照组大鼠颈背部皮下注射等体积生理盐水，连续8周。造模结束后，拟老化组和对照组各分为三个年龄亚组:4个月龄组（即造模完成后0个月）、10个月龄组（即造模完成后6个月）和16个月组（即造模完成后12个月）。每个亚组27只SD大鼠。完成造模后，检测每只大鼠听性脑干反应（Auditory Brainstem Response，ABR）；酶标仪比色法检测总超氧化歧化酶（Total Superoxide Dismutase，T-SOD）的变化以及还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽比值（Glutathione：Oxidant glutathione,GGSH:GSSG）的变化；高效液相色谱分析法和酶标仪比色法检测丙二醛(Malondialdehyde，MDA)浓度的变化；实时定量 PCR检测听皮层线粒体DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)常见缺失（Commen Deletion,CD）的变化；通过甲苯胺蓝染色来检测听皮层组织细胞数量变化；通过透射电镜（Transmission electron microscopy，TEM）来检测大鼠听皮层组织细胞超微结构的变化；通过原位末端标记法（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase(TdT)-mediated Deoxyuridine Triphosphate(dUTP) Nick-End-Labelling TUNEL）来观察神经元细胞凋亡情况。
　　结果：ABR结果示在4月龄，10月龄，16月龄时，相同频率（4kHz、8kHz、16kHz、24kHz、32kHz）拟老化组和对照组比较，阈值变化不具备统计学差异（P>0.05）；比色法结果示：与对照组相比，10月龄与16月龄拟老化组大鼠听皮层SOD活性降低（P<0.01）,GSH:GSSG比值降低（P<0.05）；比色法与高效液相色谱法显示，拟老化组 MDA浓度明显增加(P<0.05)；甲苯胺蓝染色示，拟老化组大鼠听皮层组织神经元与同月龄对照组相比数量降低，16月龄时，变化具有统计学差异（P<0.05）；电镜检测结果显示，同月龄的拟老化组与对照组大鼠相比神经纤维脱髓鞘样变、线粒体肿胀、脂褐素沉积、染色质固缩、细胞核变形等细胞超微结构退行性变更为明显且出现时间更早；TUNE染色结果显示，拟老化组大鼠听皮层细胞凋亡数目与同月龄的对照组大鼠相比，10月龄和16月龄细胞凋亡数目增加，差异具有统计学意义（P<0.01）。
　　结论:高剂量 D-半乳糖导致听皮层抗氧化酶活性降低、氧化应激增加、mtDNA CD蓄积、神经元细胞超微结构退行性变明显、神经元密度下降、凋亡数目增多，促进了大鼠听皮层组织的衰老过程。
　　第二部分探讨线粒体抗氧化酶Trx2在 D-半乳糖诱导的听皮层早衰中的作用
　　目的:我国社会老龄化趋势日益明显，在困扰老年人健康的慢性疾病中，老年性聋已跻身于第三位，仅次于高血压与关节炎。老年性聋是影响老年人生活质量的主要疾病之一，有研究表明老年性聋与氧化应激密切相关，然而老年性聋的具体发病机制尚不明确。硫氧还蛋白2（Thioredoxin2,Trx2)是特异位于线粒体的小分子蛋白，它在抗氧化应激、阻止线粒体介导的细胞凋亡等方面发挥着不可忽略的作用。本项研究意在探讨Trx2在D-半乳糖诱导的听皮层拟老化中的可能的作用机制。
　　方法：2个月龄SD雄性大鼠114随机分为对照组和拟老化组：其中拟老化组大鼠给予颈背部皮下注射500mg/kg/d的D-半乳糖，连续8周；对照组大鼠颈背部皮下注射等体积生理盐水，连续8周。造模结束后，拟老化组和对照组各分为三个年龄亚组:4个月龄组（即造模完成后0个月）、10个月龄组（即造模完成后6个月）和16个月组（即造模完成后12个月）。RT-PCR检测硫氧还蛋白2(Thiredoxin2,Trx2)，硫氧还蛋白结合蛋白(Thioredoxin-Interacting Protein,TXNIP)和凋亡信号调节激酶1（Apoptosis Signal Regulating Kinase1，ASK1）mRNA表达；western blot检测 Trx2,TXNIP和ASK1蛋白表达；western blot检测ASK1活性变化；免疫共沉淀检测Trx2-TXNIP及Trx2-ASK1复合体的变化；免疫荧光技术检测 Trx2和ASK1在听皮层组织的表达及定位；免疫组织化学技术检测TXNIP在听皮层组织的表达及定位。
　　结果：RT-PCR结果显示：与对照组相比，拟老化组大鼠Trx2 mRNA水平在4月龄，10月龄和16月龄分别下降了1.16-，1.40-(P<0.01)，和1.45-倍(P<0.01)，TXNIP mRNA水平分别上升了1.39-(P<0.05)，1.40-(P<0.01)，和1.50-倍(P<0.05)，ASK1mRNA水平分别上升了1.18-,1.25-(P<0.01),和1.26-倍(P<0.01)；在对照组，16月龄大鼠与4月龄大鼠相比，Trx2 mRNA水平降低了1.29倍(P<0.05)，而TXNIP与ASK1 mRNA水平分别升高了1.59-(P<0.05)和1.12-倍。在拟老化组，16月龄大鼠与4月龄大鼠相比，Trx2 mRNA水平降低了1.29倍(P<0.05)，而TXNIP与ASK1 mRNA水平分别升高了1.71倍(P<0.01)和1.42倍。Western blot结果显示：与对照组相比，拟老化组大鼠在4月龄，10月龄和16月龄中 Trx2水平分别降低1.50-，1.61-(P<0.05)和1.56-倍(P<0.05)，TXNIP水平分别上升了1.34-(P<0.05),1.44-(P<0.05),和1.57-倍(P<0.05)，ASK1水平分别上升了1.15-,2.19-(P<0.01)和2.17-倍(P<0.01)；我们的western blot结果还显示，在对照组和拟老化组，Trx2蛋白随着年龄的增长而降低，而TXNIP和ASK1蛋白水平随年龄的增长而升高。在对照组中，16月龄与4月龄相比，Trx2蛋白下降1.54倍，TXNIP蛋白上升1.42倍（P<0.05），ASK1蛋白上升1.59倍。在拟老化组中，16月龄与4月龄相比，Trx2蛋白下降1.77倍(P<0.01)倍，TXNIP蛋白上升2.30-倍（P<0.01），ASK1蛋白上升1.75-倍（P<0.05）。此外，ASK1活性在拟老化组明显增加，并且随着年龄的增长而增加（P<0.01）。免疫沉淀结果显示：Trx2-TXNIP和Trx2-ASK1复合体仅存在于线粒体，并且与对照组相比，4月龄，10月龄和16月龄拟老化组 Trx2-TXNIP复合体分别增加了1.63-(P<0.05),1.21-(P<0.05)和1.26-倍(P<0.01)，而Trx2-ASK1复合体分别降低了1.09-(P<0.05),1.48-(P<0.01)和1.37-倍(P<0.05)。与此同时，我们还发现，Trx2-TXNIP复合体随年龄的增加而增多，但Trx2-ASK1复合体随年龄的增加而减少。在对照组，16月龄大鼠与4月龄大鼠相比，Trx2-TXNIP复合体增加了2.38倍（P<0.01）而Trx2-ASK1复合体降低了2.61倍(P<0.01)。在拟老化组，16月龄大鼠与4月龄大鼠相比，Trx2-TXNIP复合体增加了2.99倍(P<0.01)而 Trx2-ASK1复合体降低了2.01(P<0.01)倍。
　　结论：听皮层Trx2的下降和TXNIP-Trx2-ASK1信号通路的改变导致听皮层抵抗氧化应激能力下降，进而导致ROS生成增加,神经元超微结构的改变以及氧化应激累积，线粒体功能障碍和异常增多的细胞凋亡。这些变化促使老年性聋的出现。

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英文缩略词表

中文摘要

英文摘要

前言

参考文献

第一部分D-半乳糖诱导的听皮层拟老化大鼠模型的建立

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 探讨线粒体抗氧化酶Trx2在D-半乳糖诱导的听皮层拟老化中的作用

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

综述:硫氧还蛋白在老化过程中的作用

附录

致谢