异氟醚暴露后大鼠皮层microRNAs表达变化

摘要

目的：
　　1、本研究通过大鼠异氟醚麻醉模型，利用高通量microRNA芯片技术检测不同浓度异氟醚暴露后大鼠皮层中microRNAs表达谱变化，并对其进行生物信息学分析。
　　2、通过荧光素酶报告法在细胞水平对具有显著性差异表达的microRNAs所预测的靶基因进行验证。
　　方法：
　　1、大鼠异氟醚麻醉模型的建立及检测不同浓度异氟醚暴露后大鼠皮层中microRNAs表达谱变化：雄性SD大鼠12只，体重250±10g，随机分为对照组（Sham）、2.0％异氟醚吸入组（P1组）、1.5%异氟醚吸入组（P2组）、0.75%异氟醚吸入组（P3组），各实验组均麻醉维持4h。麻醉结束后24h取大鼠大脑皮层组织，提取总RNA，通过高通量microRNA芯片技术检测各组microRNA表达谱，筛选出显著差异表达的microRNAs，并通过RT-qPCR验证结果。利用GO-Analysis进行生物信息学分析，统计采用χ2检验和fisher检验的原理，计算得到p值与p(k)值，后多重比较，得出GO-Analysis的误判率（FDR），根据FDR值判断差异是否具有显著性；Pathway-Analysis是应用fisher精确检验和χ2检验对microRNAs可能参与的所有Pathway进行分析。
　　2、荧光素酶报告法检测rno-let-7d可以调控靶基因PIK3IP1：rno-let-7d为异氟醚暴露后大鼠皮层表达发生变化的miRNA之一，利用 targetscan软件预测到rno-let-7d可能参与调控靶基因PIK3IP1，通过PIK3IP13’UTR预测靶点构入荧光素酶报告质粒，利用rno-let-7d mimics及阴性对照microRNA-NC分别和PIK3IP1野生型靶标共转做双荧光检测，转染48h后观察细胞状态并拍照，并裂解细胞，测试luciferase活性。
　　结果：MicroRNA芯片检测结果显示在不同浓度异氟醚暴露后中大鼠皮层共有29个microRNAs发生了表达变化具有显著性：其中在2.0%异氟醚吸入组（P1组）中19个，1.5%异氟醚吸入组（P2组）13个，0.75%异氟醚吸入组（P3组）4个（三组部分重叠）。通过随机挑选的部分表达差异具有显著性miRNAs进行RT-PCR检测证明microRNA芯片结果是真实有效。这些microRNAs参与调控以下信号通路如Metabolic pathways（代谢途径）、MAPK信号通路（MAPK signaling pathway）、T细胞受体信号传导途径（T cell receptor signaling pathway）、PI3K-Akt信号传导途径（PI3K-Akt signaling pathway）、神经营养因子信号通路（Neurotrophin signaling pathway）等。let-7d为异氟醚暴露后大鼠皮层表达发生变化的microRNA之一，通过 let-7d mimics表达后测试luciferase活性发现，其对PIK3IP13’UTR有抑制作用，从而证实PIK3IP1是let-7d的靶基因。
　　结论：本研究通过microRNA芯片技术对暴露于不同浓度（2%、1.5%、0.75%）的异氟醚大鼠大脑皮层microRNAs进行表达谱分析，发现了异氟醚暴露可以显著性改变29个microRNAs表达，并可能影响它们参与调控的信号通路活动。应用相关软件预测并验证得出let-7d的靶基因为PIK3IP1。

目录

封面

声明

目录

中英文缩略表

中文摘要

英文摘要

前言

第一部分大鼠异氟醚麻醉模型的建立及microRNAs表达谱的检测

材料和方法

结果

第二部分荧光素酶报告法验证rno-let-7d靶基因为PIK3IP1

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述： MicroRNA对神经系统作用的研究进展

硕士期间参与发表文章

致谢