TAK1通过激活p38 MAPK负性调节血管平滑肌细胞中IL-1α诱导的SDF-1表达

摘要

目的：明确IL-1α对血管平滑肌细胞中SDF-1表达的影响，探讨蛋白激酶TAK1对SDF-1表达的调控作用及其相关机制，研究血管平滑肌细胞中TAK1信号对骨髓间充质干细胞迁移的影响。
　　方法：体外分离培养原代大鼠血管平滑肌细胞，并予以重组大鼠IL-1α处理，采用qRT-PCR及ELISA检测血管平滑肌细胞SDF-1的表达。构建RNA干扰慢病毒载体用于细胞感染，获得C/EBPβ或TAK1表达被敲低的血管平滑肌细胞并用于实验。以Western blotting检测C/EBPβ和TAK1的表达和磷酸化水平，结合对SDF-1表达的检测，明确TAK1对SDF-1表达的影响及C/EBPβ在其中的作用。Western blotting检测TAK1敲低对TAK1及其下游激酶（IKKβ，ERK，JNK和p38 MAPK）磷酸化的影响。然后，观察不同的抑制剂预处理对C/EBPβ和SDF-1表达的调控作用，并进而比对同一种抑制剂在不同细胞（TAK1或 C/EBPβ被敲低的细胞及相应的对照细胞）中的调控效应的差异，识别在 TAK1下游介导其对SDF-1表达的影响的信号通路。观察TAK1敲低和相关的下游信号抑制剂对经活性氧清除剂预处理的血管平滑肌细胞中NRF2、C/EBPβ和SDF-1表达的影响，进一步探讨TAK1调控SDF-1表达的分子机制。最后，以 Transwell细胞迁移试验检测血管平滑肌细胞条件培养上清对骨髓间充质干细胞迁移活性的诱导作用，结合SDF-1的中和抗体和CXCR4拮抗剂的使用，探讨血管平滑肌细胞中TAK1信号对骨髓间充质干细胞迁移活性的影响及机制。
　　结果：IL-1α可以通过诱导C/EBPβ的表达上调促进SDF-1的mRNA转录和蛋白表达，该诱导作用可被IKKβ抑制剂阻断。TAK1敲低可减弱IL-1α诱导的IKKβ、ERK、JNK和p38 MAPK的磷酸化，但在TAK1表达被敲低的血管平滑肌细胞中，IL-1α诱导的C/EBPβ和SDF-1表达却显著增强。另一方面，在ERK、JNK和p38 MAPK的抑制剂中，只有p38 MAPK抑制剂可明显增强IL-1α诱导的C/EBPβ和SDF-1表达。在IL-1α处理的细胞中，TAK1敲低和p38 MAPK抑制剂都能引起程度相当的C/EBPβ和SDF-1表达增强，但p38 MAPK抑制剂并不能进一步升高TAK1表达被敲低的细胞中 IL-1α诱导的 SDF-1表达；且 TAK1敲低和p38 MAPK抑制剂对IL-1α诱导的SDF-1表达的增强作用也都可被C/EBP?敲低明显减弱。进一步实验显示，TAK1敲低和p38 MAPK抑制剂均可增强IL-1α处理的血管平滑肌中ROS依赖性的NRF2上调，且TAK1敲低和p38 MAPK抑制剂对IL-1α诱导的C/EBPβ和SDF-1表达的增强作用均可被ROS清除剂和NRF2抑制剂所消除。Transwell细胞迁移试验的结果也显示，与PBS处理的血管平滑肌细胞条件培养上清相比，IL-1α处理的血管平滑肌细胞条件培养上清能明显诱导SDF-1/CXCR4信号依赖的骨髓间充质干细胞迁移，且血管平滑肌细胞TAK1基因敲低能进一步增强该诱导效应。
　　结论：在血管平滑肌细胞中，IL-1α可通过诱导 IKKβ信号依赖的 C/EBPβ的上调促进SDF-1的表达，而位于IKKβ上游的TAK1也可通过激活p38 MAPK对IL-1α诱导的C/EBPβ和SDF-1的表达发挥负性调节作用。另一方面，在IL-1α处理的血管平滑肌细胞中，TAK1的敲低可促进SDF-1/CXCR4信号依赖的骨髓间充质干细胞迁移。因此，这些结果表明TAK1是血管平滑肌SDF-1表达及SDF-1/CXCR4信号依赖的骨髓间充质干细胞迁移的重要调节因子，也是调节血管修复和重塑、优化炎症相关血管疾病治疗的潜在靶点。

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英文缩略词表

中文摘要

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绪论

研究背景

研究内容

技术路线图

研究目标

参考文献

引言

材料与方法

动物

主要试剂与抗体

血管平滑肌细胞的培养和处理

骨髓间充质干细胞的分离和培养

RNA干扰慢病毒载体的构建与制备

RNA干扰慢病毒载体的感染

细胞总蛋白提取及蛋白浓度检测

酶联免疫吸附试验（ELISA）

实时荧光定量PCR

免疫印迹

Transwell细胞迁移试验

统计学分析

结果

1、 IL-1α通过上调C/EBP?促进血管平滑肌细胞中SDF-1的表达。

2、IL-1α以IKKβ信号依赖的方式诱导血管平滑肌细胞中C/EBPβ和SDF-1的表达。

3、血管平滑肌细胞中IL-1α诱导的SDF-1的表达受TAK1的负性调节。

4、 TAK1通过抑制C/EBPβ表达抑制IL-1α诱导的SDF-1表达。

5、 TAK1通过激活p38 MAPK信号减弱血管平滑肌细胞中IL-1α诱导的SDF-1表达。

6、 TAK1/p38 MAPK信号通路通过拮抗ROS依赖的NRF2上调负性调控IL-1α诱导的SDF-1表达。

7、TAK1信号通路通过抑制血管平滑肌细胞表达SDF-1调控骨髓间充质干细胞的迁移。

结果图表

讨论

结论

参考文献

综述：SDF-1信号的调节及其在血管重构中的作用

致谢

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