L型电压门控钙通道Cav1.3 C末端对神经元突起发育的调控作用

摘要

胞内Ca2+浓度的变化可以调控众多细胞生理事件，包括肌肉收缩、突触传递、基因表达、细胞分泌、存活、增殖和分化。电压门控钙通道（Voltage-gatedcalciumchannels，VGCCs）是钙离子进入细胞的重要途径，也是将电信号转化成胞内生物化学信号所必须的元件。L型电压门控钙通道（L-typevoltage-gatedcalciumchannels，LTCC）作为VGCCs家族的重要成员，不仅在短时程调控内分泌细胞的分泌活动以及神经元、肌细胞的电活动和生物化学特性中发挥重要作用，还可通过复杂的胞内信号途径调控基因转录进而调控神经元的长时程活动。Cav1.2和Cav1.3作为LTCC家族的重要亚型高表达于大脑，在大脑的许多生理以及病理过程中发挥重要作用，与大脑的学习、记忆、药物成瘾性以及神经元发育等多方面密切相关。但是Cav1.2和Cav1.3是以怎样的调控方式在许多生理和病理过程中发挥作用，目前尚不十分明确，其中对Cav1.3更是知之甚少。越来越多的研究表明，通过调控基因转录影响神经元长时程活动是Cav1.2和Cav1.3一个特异性的调控方式，而通道的羧基末端是决定Cav1.2和Cav1.3的具有这种特殊功能的结构基础。Gomez-Ospina的最新研究表明LTCC的C末端可以作为一个独立的肽段或蛋白转移入核，直接调控神经元信号和神经元兴奋性的相关基因表达。Cav1.3与Cav1.2具有75％的序列同源性，它们往往在不同类型的神经元内共同表达，表明两个通道具有不同的细胞功能。但是，Cav1.3C末端是否可以提供特定的信号以激活相应基因转录并最终影响神经元发育，目前未见报道。本实验应用形态学技术、电生理技术和分子生物学技术，对Cav1.3C末端在神经元的定位分布和对神经元突起的发育的影响进行了相关研究。
　　本研究主要内容包括：⑴构建了YFP-Cav1.3表达载体，将其与辅助亚基β1b、α2δ瞬时共转至无内源性L型钙通道表达的HEK293T细胞中，激光扫描共聚焦显微镜观察到Cav1.3主要在细胞质中表达，并且呈一定的内质网形态，但是Cav1.3在核内没有表达；全细胞记录模式电压膜片钳技术检测到外源性表达的Cav1.3通道具有高电压激活，慢速电压依赖性失活以及大的单通道电导的L型钙通道电生理特性；但与Cav1.2相比，Cav1.3通道激活电压更负，激活速度更快，失活速度更慢。以上结果表明外源性Cav1.3在HEK293T细胞中功能性表达。⑵用内质网钙泵抑制剂TG耗竭HEK293T细胞（过表达Cav1.3）中的钙库，随后给予细胞去极化刺激，用Fura-2-AM钙定量测定技术来检测胞内游离钙离子的变化，结果显示用内质网钙泵抑制剂TG耗竭钙库后，HEK293T细胞外源性表达的Cav1.3通道活性显著下降。结果表明内质网钙库的耗竭抑制Cav1.3通道活性。⑶将构建的Cav1.3C末端表达载体Cav1.3CT-YFP转入HEK293T和Hela细胞中，采用激光共聚焦显微镜成像技术发现Cav1.3C末端未在细胞质中表达，而是特异性的表达于细胞核，并形成斑点（punctate）聚集存在。⑷应用核定位序列（NLS）预测软件预测Cav1.3C末端（包含695氨基酸）可能存在的NLS，发现两个潜在NLS片段：153-160的8个氨基酸（RKFKKRKE）和440-446的7个氨基酸（PRRRLLP）；进一步采用重组PCR方式将Cav1.3C末端分别进行单片段缺失突变（Δ153-160，简写为Δ153；Δ440-446，简写为Δ440）和双片段缺失突变（Δ153-160+Δ440-446，简写为Δ153-Δ440），获得NLS片段缺失表达载体Cav1.3-CT-Δ153-YFP、Cav1.3-CT-Δ440-YFP、Cav1.3-CT-Δ153-Δ440-YFP，将它们分别转染至胞核较大的Hela细胞中。结果显示NLS单片段缺失突变和双片段缺失突变的Cav1.3C末端蛋白仍然能够入核，但其在核内形成的斑点（punctate）显著减少。⑸分离培养孕18d大鼠胎鼠的脑皮层神经元，培养48h后，分别共转YFP-N1+mCherry-N1（对照组）、Cav1.3CT-YFP+mCherry-N1（实验组）、Cav1.3-CT-Δ153-Δ440-YFP+mCherry-N1（纠正组），激光共聚焦显微镜观察，结果显示：Cav1.3C末端蛋白仅定位在神经元核内，且实验组与对照组比较发现神经元的突起的总长度和总数目都明显减少；而Cav1.3-CT-Δ153-Δ440蛋白在神经元内的细胞核和突起中均有表达，纠正组和实验组比较，虽然神经元突起的总数目没有增加，但是突起的总长度却明显增加。上述结果表明Cav1.3C末端能够影响神经元突起的发育，其两个潜在NLS片段可能发挥关键作用。⑹将Cav1.3CT-YFP与NFAT-CFP共转至HEK293T细胞中，激光共聚焦显微镜成像技术发现二者在细胞核内存在明显共定位，提示Cav1.3C末端可能通过与NFAT的相互作用影响其功能。⑺研究表明：①构建的全长Cav1.3通道表达载体YFP-Cav1.3能够在细胞内功能性表达，Cav1.3与YFP标签蛋白融合并不影响通道活性。②Cav1.3C末端能够影响神经元突起的发育，其两个潜在NLS片段可能发挥关键作用。

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综述:L型电压门控钙通道

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