星形胶质细胞来源的IL-17A对缺血性脑卒中神经再生和功能恢复的影响及机制研究

摘要

第一部分 IL-17A在缺血性脑卒中（CIS）恢复期的表达变化以及神经再生和功能恢复的影响
　　目的：确定CIS后IL-17A的时间与空间表达趋势，以及明确IL-17A是否可促进CIS后神经再生与功能恢复。
　　方法：成年雄性IL-17A敲除（IL-17A knock-out，il-17a-/-）或野生型（wide-type，WT）小鼠大脑中动脉栓塞，缺血60分钟后再灌注。野生型小鼠从CIS后14天开始，连续14天经鼻腔给予重组白介素17A蛋白（recombinant IL-17A，rIL-17A）或溶剂对照（vehicle），或者经侧脑室给予小鼠IL-17A中和抗体（anti-IL-17A mAb）或IgG1同型对照抗体。CIS后27天腹腔注射BrdU，间隔8个小时，16小时后灌注取材检测祖细胞增殖活性。CIS后7天腹腔注射BrdU，间隔8个小时候再次注射一次，连续注射7天，35天灌注取材检测祖细胞寿命。CIS后1、3、7、14、21、28、42或70天免疫印迹和实时定量PCR检测缺血侧大脑半球IL-17A的表达。CIS后7、14、21或28天免疫荧光和免疫印迹检测脑室下区（subventricularzone，SVZ）和海马区IL-17A的表达。CIS后28或35天免疫细胞化学染色溴脱氧尿苷（bromodeoxyuridine，BrdU），Ki67，磷酸化组蛋白H3（phospho-histone H3，PH3），双皮质素（doublecortin，DCX）。CIS后35天免疫细胞化学检测β3-tubulin和突触素（synaptophysin）；免疫印迹检测突触小体相关蛋白-25（synaptosomal-associated protein-25 kDa，SNAP-25）；以及小鼠行为学评分。
　　结果：免疫印迹和实时定量PCR结果显示与假手术组相比，CIS后7、14、21和28天缺血侧大脑半球IL-17A的基因与蛋白表达水平显著升高，28天达峰值。缺血侧SVZ和纹状体区IL-17A阳性细胞数在CIS后7、14、21和28天显著增加。CIS后28天，抑制 IL-17A可显著减少纹状体 BrdU+/DCX+细胞数，而 rIL-17A可显著增加纹状体BrdU+/DCX+细胞数。然而抑制IL-17A或rIL-17A不影响CIS后28天SVZ区BrdU+、Ki67+或 PH3+细胞数。CIS后35天，抑制 IL-17A显著减少缺血侧 SVZ区 BrdU+、BrdU+/DCX+细胞数，显著减少纹状体BrdU+/DCX+细胞数，而rIL-17A则增加缺血侧SVZ区BrdU+、BrdU+/DCX+细胞数，显著增加纹状体BrdU+/DCX+细胞数。抑制IL-17A还可显著减少缺血侧纹状体BrdU+/βIII-tubulin+细胞数，减少SNAP-25和synaptophysin的表达，显著抑制CIS后神经功能的恢复，rIL-17A可显著增加BrdU+/βIII-tubulin+细胞数，增加SNAP-25和synaptophysin的表达，显著促进CIS后神经功能的恢复。结论：CIS恢复期在SVZ和纹状体区升高的IL-17A可显著增加SVZ区神经祖细胞寿命，促进神经元分化和突触再生，从而促进神经功能恢复。
　　第二部分 p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）/calpain1信号通路在CIS后IL-17A的促神经再生中的作用
　　目的：探讨白介素17A促进CIS后神经再生的分子生物学机制。
　　方法：WT小鼠大脑中动脉栓塞，缺血60分钟后再灌注。小鼠从CIS后14天开始，连续14天经鼻腔给予重组白介素17A蛋白（recombinant IL-17A，rIL-17A）或溶剂对照（vehicle），或者经侧脑室给予小鼠IL-17A中和抗体（anti-IL-17A mAb）或IgG1同型对照抗体。CIS后27天腹腔注射BrdU，间隔8个小时，16小时后灌注取材检测祖细胞增殖活性。其中部分小鼠在鼻腔给予rIL-17A前30分钟腹腔给予p38通路抑制剂SB203580或1％ DMSO，或者经侧脑室给予calpain1抑制剂PD151746或1%DMSO。CIS后28天免疫印迹检测 IL-17A，磷酸化细胞外调节蛋白激酶（phospho-extracellular regulated protein kinase，p-ERK），磷酸化c-Jun氨基末端激酶（phospho-c-Jun N-terminal kinase，p-JNK），磷酸化AKT（p-AKT），磷酸化p38(p-p38)，aII-spectrin，calpain1和calpain2的蛋白表达。CIS后35天免疫细胞化学染色BrdU、DCX、β3-tubulin和突触素（synaptophysin）；免疫印迹检测SNAP25。
　　结果：IL-17A敲除，中和抗体中和IL-17A或rIL-17A干预均不影响CIS后28天缺血侧脑组织p-ERK，p-JNK，p-AKT和calpain2的蛋白表达；抑制IL-17A显著减少缺血侧脑组织p-p38蛋白表达；而rIL-17A干预显著增加p-p38蛋白表达。IL-17A敲除，中和抗体中和IL-17A可显著增加CIS后28天总calpain和calpain1的活性，而rIL-17A干预则显著抑制总calpain和calpain1的活性。SB203580可显著增加CIS后28天缺血侧脑组织calpain1活性。提前加入SB203580则可阻断IL-17A对总calpain和calpain1活性的抑制作用。然而 PD151746则对IL-17A和p-p38的蛋白表达无显著影响。PD151746干预可显著增加 CIS后35天缺血侧纹状体 BrdU+/DCX+和BrdU+/β3-tubulin+细胞数，也显著增加synaptophysin和SNAP25的表达。
　　结论：IL-17A通过p38 MAPK/calpain1信号通路促进CIS后神经再生。
　　第三部分 IL-17A在CIS后的细胞来源以及分泌机制
　　目的：明确IL-17A在CIS恢复期的细胞来源，以及探讨其细胞分泌机制。
　　方法：WT小鼠大脑中动脉栓塞，缺血60分钟后再灌注。CIS后28天免疫荧光双染IL-17A和星形胶质细胞标记GFAP，神经元标记NeuN或小胶质细胞标记Iba-1。CIS后14天缺血侧 SVZ区提取的原代星形胶质细胞培养，100 ng/ml脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）干预后免疫荧光和免疫印迹分别检测细胞裂解液和培养上清液中IL-17A的蛋白表达；p38 MAPK特异性抑制剂SB203580或1%DMSO在LPS干预前30分钟加入原代星形胶质细胞培养液中。
　　结果：在体实验结果表明IL-17A与星形胶质细胞标记GFAP共表达，而不与小胶质细胞标记Iba-1或神经元标记NeuN共表达。体外培养的原代星形胶质细胞实验结果显示，LPS可显著增加细胞裂解液和培养上清液中 IL-17A的蛋白表达；而加入SB203580后，LPS对细胞裂解液和培养上清液中IL-17A的表达促进作用显著被抑制。
　　结论：星形胶质细胞是CIS恢复期IL-17A的主要细胞来源；星形胶质细胞分泌IL-17A依赖于p38 MAPK信号通路。
　　第四部分 IL-17A对体外培养的SVZ区神经祖/干细胞的增殖和分化的影响及其作用机制
　　目的：研究 IL-17A对体外培养的原代神经干/祖细胞（neural stem/progenitor cells，NSCs）的增殖分化的影响，并探讨其作用机制。
　　方法：成年雄性IL-17A敲除（IL-17A knock-out，il-17a-/-）或野生型（wide-type，WT）小鼠大脑中动脉栓塞，缺血60分钟后再灌注。CIS后14天分离缺血侧SVZ区NSCs培养。第二代神经球接种后增殖，WT小鼠CIS后来源的第二代NSCs增殖液中连续7天给予0、10、50和100 ng/ml rIL-17A干预后24小时计数神经球数量；收集细胞接种后分化，加入BrdU后16小时免疫荧光检测BrdU阳性细胞的比例。来源于il-17a-/-小鼠的第二代NSCs分化后7天，以及rIL-17A（0、10、50和100 ng/ml）或活化的星形胶质细胞培养上清（加或不加 anti-IL-17A mAb）干预的 WT小鼠第二代 NSCs分化后7天，免疫荧光双染β3-tubulin和GFAP。IL-17A中和抗体（anti-IL-17A mAb）或IgG1同型对照抗体与rIL-17A于分化开始后2小时同时加入分化液中。p38 MAPK特异性抑制剂SB203580在干预前30分钟加入分化液中。第二代NSCs分化后2小时加入calpain1特异性抑制剂PD151746，连续给7天。免疫印迹检测p-p38，calpain1和calpain2的蛋白表达。
　　结果：IL-17A敲除后NSCs分化为β3-tubulin阳性神经元显著减少；10或50 ng/ml rIL-17A干预或者活化的星形胶质细胞上清干预后NSCs分化为β3-tubulin阳性神经元显著增加，而分化为GFAP阳性星形胶质细胞显著减少。Anti-IL-17A mAb显著阻断活化的星形胶质细胞上清对NSCs神经元分化的促进作用。给予 rIL-17A显著增加p-p38蛋白表达和calpain1活性。rIL-17A对p-p38蛋白表达的促进作用以及对calpain1活性的抑制作用可被 anti-IL-17A mAb显著阻断。预先给予 SB203580显著阻断rIL-17A对calpain1活性的抑制作用；而PD151746对p-p38蛋白表达无显著影响。PD151746显著增加NSCs分化为β3-tubulin+神经元而减少GFAP+星形胶质细胞。
　　结论：IL-17A通过p38 MAPK/calpain1信号通路促进体外培养的原代NSCs的神经元分化。

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英文缩略词表及中文对照

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前言

参考文献

第一部分IL-17A 在缺血性脑卒中（CIS）恢复期的表达变化以及对神经再生和功能恢复的影响

引言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）/calpain 1信号通路在CIS后IL-17A的促神经再生中的作用

引言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第三部分IL-17A在CIS后的细胞来源以及分泌机制

引言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第四部分IL-17A对体外培养的SVZ区神经祖/干细胞的增殖和分化的影响及其作用机制

引言

材料与方法

结果

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参考文献

全文总结

综述: 缺血性脑卒中后神经血管再生重塑和功能恢复的研究进展

附录 攻读博士学位期间发表文章

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