哮喘和变应性鼻炎中线粒体氧化呼吸链和活性氧的研究

摘要

第一部分哮喘患者外周血单个核细胞中线粒体氧化呼吸链和活性氧的研究
　　背景和目的：哮喘是一项世界性的健康问题。氧化应激在哮喘的发病中起着重要作用，当气道暴露于各种烟尘、污染物、变应原的环境时，这些刺激物刺激上皮细胞线粒体导致氧化损害，打破了氧化和抗氧化的平衡，导致氧化应激，最终引发气道炎症。有研究提示氧化应激的增加会导致上皮炎性细胞激活并致活性氧（ROS）生成，而线粒体呼吸链又是生物活性氧（ROS）的主要来源。本研究拟以骨骼肌线粒体呼吸链激活路径为基础，建立PBMC线粒体氧化呼吸链功能的检测方法，通过电子顺磁共振技术直接检测哮喘控制和未控制患者活性氧（ROS）释出及线粒体氧化呼吸链活性，来评估氧化应激和外周全血ROS与哮喘控制程度的相关性。
　　方法：(1)外周血单个核细胞线粒体呼吸链检测方法建立：选取18到45岁男女健康志愿者共20（n=20）人，使用高分辨率呼吸运动计量仪，在同等条件下，比较两种线粒体复合物I激活剂的活性，并以骨骼肌线粒体呼吸链激活路径为模板，建立人PBMC线粒体呼吸链氧通量的检测方法。(2)哮喘患者外周血单个核细胞线粒体呼吸链及 ROS的研究：选取18到45岁男女志愿者共36人分为三组，正常对照组14人（n=14），哮喘控制组11人（n=11），哮喘未控制组11人（n=11）。使用多功能细胞呼吸代谢生理监测分析仪，测量外周血单个核细胞线粒体氧化呼吸链氧通量，运用电子顺磁共振（EPR）测量外周血氧活性氧（ROS）产出量。
　　结果：(1)外周血单个核细胞线粒体呼吸链检测方法建立：丙酮酸盐+苹果酸盐组合（pyruvate+ malate）和谷氨酸盐+苹果酸盐组合（glutamate+ malate）这两组复合物 I的激活剂在正常人群单个核细胞线粒体氧化呼吸链中的作用类似。成功建立人PBMC线粒体呼吸链氧通量的检测方法。(2)哮喘患者外周血单个核细胞线粒体呼吸链及 ROS的研究：哮喘未控制组外周血单个核细胞线粒体氧化呼吸中各阶段氧通量较正常对照组有不同程度下降。哮喘未控制VADP段氧通量较正常对照组明显下降（6.6±1.0 vs10.1±1.1 pmol/s/10^6cell，*p<0.05）。反映线粒体氧化磷酸化的耦合程度的ACR值（Vmax/V0，基础代谢状态）未显示明显差异（3.2±0.3 vs3.3±0.2 vs3.8±0.8）。哮喘未控制组 ROS的生成与正常对照组相比显著增高（0.7±0.04 vs0.5±0.03μmol/min,*p<0.05）。
　　结论：(1)丙酮酸盐+苹果酸盐组合（pyruvate+ malate）和谷氨酸盐+苹果酸盐组合（glutamate+ malate）均可作为复合物 I的激活剂用于人外周血单个核细胞线粒体的研究。在线粒体氧化呼吸链中不同的激发路径可能会影响复合物活性的发挥。(2)线粒体氧化呼吸链的功能与哮喘的控制程度相关，哮喘控制程度越低可能线粒体氧化呼吸链功能越弱。
　　第二部分鼻粘膜激发实验中线粒体呼吸链氧通量和活性氧的动态监测及与嗜酸性粒细胞的相关性研究
　　背景和目的：变应性鼻炎是一种常见的呼吸道变应性疾病，大量研究表明，变应性鼻炎与哮喘在病因、发病机制和病理生理改变等方面有着相同或相似的表现。我们在第一部分的研究提示氧化应激和活性氧（ROS）在哮喘发病过程中可能发挥重要作用。本部分研究拟通过鼻粘膜激发试验模拟出变应性鼻炎发作的动态条件，通过检测患者外周血活性氧（ROS）释出量及 PBMC线粒体氧化呼吸链氧通量，来探讨氧化应激和活性氧（ROS）在变应性鼻炎发病中的变化。
　　方法：本研究选取11位18到55岁对牧草花粉过敏的变应性鼻炎患者，每位参与者随机参与两次花粉鼻粘膜激发试验（激发物和安慰剂）。并于激发前（t0）和激发后6小时（t6）及24小时（t24）收集鼻粘膜灌洗液及外周静脉血，流式细胞术分析鼻粘膜灌洗液中嗜酸性粒细胞含量，显微镜下分析外周嗜酸性粒细胞分类计数，使用多功能细胞呼吸代谢生理监测分析仪测量外周血单个核细胞线粒体氧化呼吸链氧通量，运用电子顺磁共振（EPR）测量外周血活性氧（ROS）产出量。
　　结果：牧草花粉鼻粘膜激发后24小时内，11名受试者鼻腔灌洗液和外周静脉血中嗜酸性粒细胞百分比均持续上升。变应原激发6小时后（t6），外周血单核细胞线粒体氧化呼吸链VADP段氧通量较t0和t24显著降低(2.1±0.4 vs4.7±0.9 pmol/s*mill,*p<0.05；2.1±0.4 vs6.2±0.7 pmol/s*mill,*p<0.01)，提示线粒体功能损害。变应原激发6小时后线粒体氧化磷酸化的耦合程度的ACR值（Vmax/V0，基础代谢状态）显著低于激发后24小时（1.8±0.3 vs3.9±0.7,*p<0.05）。并且VADP段氧通量与外周静脉血嗜酸性粒细胞百分比呈显著负相关（R2=0.40,*p<0.05），与鼻腔灌洗液中嗜酸性粒细胞百分比没有相关性。而激发前后外周血ROS的析出未有明显差异。
　　结论：经变应原鼻激发6小时后，外周血单个核细胞线粒体呼吸链功能受损。外周血单个核细胞线粒体复合物 I功能障碍可能参与变应性鼻炎的发病过程。经变应原激发后PBMC线粒体功能损伤与外周嗜酸性粒细胞增多存在相关性，并会随着变应原的撤离而消失。

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声明

华中科技大学博士学位论文创新点概述

缩 略 词 表

第一部分 哮喘患者外周血单个核细胞线粒体氧化呼吸链和活性氧的研究

前言

材料及方法

结果

讨论

小结

第二部分 鼻粘膜激发实验中线粒体呼吸链氧通量和活性氧的动态监测及与嗜酸性粒细胞的相关性研究

前言

材料及方法

结果

讨论

小结

参考文献

综述:氧化应激和哮喘

致谢