CD4+LAP+调节性T细胞在动脉粥样硬化中作用及机制研究

摘要

第一部分 CD4+LAP+调节性T细胞在动脉粥样硬化小鼠中数量与功能变化
　　目的：研究动脉粥样硬化（AS）模型小鼠体内潜伏相关肽（LAP）+调节性T细胞（CD4+LAP+Tregs）的数量与功能变化。
　　方法：将6周大小雄性的C57BL/6J小鼠和ApoE-/-小鼠分为3组：1）10-wk C57BL/6J组（即C57BL/6J小鼠普通饮食4周）；2）10-wk ApoE-/-组（即ApoE-/-小鼠普通饮食4周）；3）20-wk ApoE-/-组（即ApoE-/-小鼠普通饮食14周）。饲养一定时间后摘眼球取血、分离脾脏和胸腺组织。检测血浆总胆固醇、oxLDL和甘油三酯的含量。应用流式细胞术检测脾脏和胸腺中CD4+CD25+LAP+细胞及CD4+CD25-LAP+Tregs细胞的比例。应用3H-胸腺嘧啶核甘（3H-TdR）渗入法检测脾脏的CD4+LAP+是否能够抑制CD4+LAP-的增殖反应。应用ELISA法检测CD3抗体刺激后脾脏细胞培养上清中IL-17和IFN-γ的浓度。
　　结果：10-wk ApoE-/-组血浆总胆固醇和ox-LDL浓度显著高于同龄的10-wkC57BL/6J组，20-wk ApoE-/-组总胆固醇和ox-LDL浓度明显高于10-wk ApoE-/-组。10-wk ApoE-/-组胸腺和脾脏中 CD4+CD25+LAP+和 CD4+CD25-LAP+ Tregs比例明显低于10-wk C57BL/6J组，20-wk ApoE-/-组胸腺和脾脏中CD4+CD25+LAP+和CD4+CD25-LAP+Tregs比例明显低于10-wk ApoE-/-组。此外，20-wk ApoE-/-组脾脏CD4+LAP+Tregs抑制功能显著低于10-wk ApoE-/-组和10-wkC57BL/6J组，而10-wk ApoE-/-组与10-wkC57BL/6J组无明显差异。20-wk ApoE-/-组脾细胞表达IFN-γ和IL-17明显高于10-wk ApoE-/-组和10-wk C57BL/6J组。
　　结论：动脉粥样硬化小鼠血浆脂质水平明显高于正常小鼠。在动脉粥样硬化小鼠中，CD4+LAP+Tregs数量显著下降和功能明显受损，且体内炎症因子表达明显增高。
　　第二部分去除 CD4+LAP+调节性 T细胞促进免疫炎症反应和小鼠动脉粥样硬化斑块形成
　　目的：通过构建动脉粥样硬化模型，观察和探讨 anti-LAP抗体是否能够去除 CD4+LAP+Tregs，及其对动脉粥样硬化斑块形成和免疫炎症反应的影响。
　　方法：将6周大小雄性的ApoE-/-小鼠分为2组：1）IC对照组（即ApoE-/-小鼠经腹腔注射50μg IgG1同型抗体，每天一次，连续五天，高脂饮食12周）；2）anti-LAP组（即ApoE-/-小鼠经腹腔注射50μg anti-LAP抗体，每天一次，连续五天，高脂饮食12周）。上述抗体干预于第9、12、15周重复，18周龄时分离血、脾脏、心脏、全主动脉。抗体干预24h后，流式细胞术检测CD4+CD25+Foxp3+细胞（即Foxp3+Tregs）和CD4+LAP+Tregs比例，应用3H-TdR渗入法检测Foxp3+Tregs的功能变化和脾脏淋巴细胞增殖反应，分离脾脏淋巴细胞培养上清并应用ELISA检测IL-17和IFN-γ的浓度。动脉粥样硬化模型建立后，分离血浆并检测甘油三酯和总胆固醇的含量，油红O染色评估主动脉窦和全主动脉斑块面积，免疫组化染色检测主动脉窦斑块 collagen、TGF-β、CD4、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、α-SMA、CD68和基质金属蛋白酶-2（MMP-2）的含量，应用流式测定脾脏中Th1（CD4+IFN-γ+）细胞、Th17（CD4+IL-17+）细胞和巨噬细胞 M1、M2的百分比，应用 RT-PCR法检测动脉粥样硬化斑块内VCAM-1、IL-10、TGF-β、IL-17、MCP-1和IFN-γmRNA的表达量。
　　结果：与IC对照组相比，anti-LAP组脾脏CD4+LAP+细胞被去除了70％，而Foxp3+Tregs细胞的数量及功能并不受影响。anti-LAP组与IC对照组相比，脾脏淋巴细胞增殖能力明显升高，且其IFN-γ和IL-17的蛋白表达明显增加。另外，IC对照组和anti-LAP组的甘油三酯和总胆固醇浓度无明显区别。与IC对照组相比，anti-LAP组主动脉窦和全主动脉斑块面积明显增加，anti-LAP组斑块内TGF-β、collagen和α-SMA含量显著减少，而CD4数量、CD68、MMP-2和MMP-9的含量均明显增加。anti-LAP组与IC对照组相比，脾脏Th17、Th1和M1细胞的数量增多，而M2细胞则下降。此外，anti-LAP能够显著上调主动脉VCAM-1、IFN-γ、IL-17和MCP-1 mRNA的含量，而下调TGF-β和IL-10 mRNA的含量。
　　结论：经腹腔注射anti-LAP抗体可有效去除ApoE-/-小鼠免疫器官中CD4+LAP+Tregs细胞。anti-LAP抗体能够促进动脉粥样硬化斑块形成和斑块不稳定，其机制为anti-LAP抗体能够去除 CD4+LAP+细胞和下调抗炎因子 TGF-β及 IL-10，从而导致炎症因子IL-17、IFN-γ和MCP-1等显著增加。
　　第三部分过继转输 CD4+LAP+调节性 T细胞减轻免疫炎症反应和小鼠动脉粥样硬化斑块形成
　　目的：通过构建动脉粥样硬化模型，观察和探讨过继转输CD4+LAP+ Tregs细胞对动脉粥样硬化斑块形成和免疫炎症反应的影响。
　　方法：应用流式细胞术分选C57BL/6J小鼠脾脏的CD4+LAP+Tregs和CD4+LAP-效应性T细胞（Teffs）用于过继转输和表型功能分析。流式检测上述两种细胞的纯度、LAP+细胞与Foxp3+细胞重叠比例、以及CD4+LAP+Tregs细胞表面CTLA-4和ICOS的表达水平。分离CD4+LAP+Tregs和CD4+LAP-Teffs细胞的上清并应用ELISA检测TGF-β和IL-10的浓度。另外，将6周大小雄性的ApoE-/-小鼠分为3组：1）PBS对照组（即ApoE-/-小鼠经尾静脉注射200μl PBS）；2）LAP+细胞组（即经尾静脉注射1×105个CD4+LAP+ Tregs）；3）LAP-细胞组（即经尾静脉注射1×105个CD4+LAP- Teffs）。上述干预于第9、12、15周重复，总共四次。经过12周高脂饮食，18周龄时分离血、脾脏、心脏、全主动脉。应用3H-TdR渗入法检测脾脏淋巴细胞增殖反应，分离脾脏淋巴细胞培养上清并应用ELISA检测IL-17和IFN-γ的浓度。检测血浆甘油三酯和总胆固醇含量。油红O染色评估主动脉窦和全主动脉斑块面积，免疫组化染色检测主动脉窦斑块 TGF-β、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、CD4、α-SMA、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、CD68和collagen的含量，应用流式测定脾脏中Th1细胞、Th17细胞和巨噬细胞 M1、M2的百分比，应用 RT-PCR法检测动脉粥样硬化斑块内 IL-17、VCAM-1、TGF-β、MCP-1、IFN-γ和IL-10 mRNA的表达量。
　　结果：经流式分选，CD4+LAP+细胞和CD4+LAP-细胞纯度分别可以达到90.5%和96%，经鉴定LAP+细胞几乎不含Foxp3。而且，CD4+LAP+细胞表面CTLA-4和ICOS的表达水平明显高于CD4+LAP-细胞，以及前者分泌TGF-β和IL-10显著高于后者。另外，与PBS对照组相比，LAP+细胞组脾脏淋巴细胞增殖明显受抑，且IFN-γ和IL-17的蛋白表达明显减少。三组之间的总胆固醇和甘油三酯水平无明显差异。与 PBS对照组相比，LAP+细胞组主动脉窦和全主动脉斑块面积明显减少，LAP+细胞组斑块内TGF-β、α-SMA和collagen含量显著增加，而CD68、CD4、MMP-2和MMP-9数量或表达明显减少。与PBS对照组相比，LAP+细胞组脾脏Th1、Th17、M1细胞比例明显减少，而M2则显著增加。此外，过继转输LAP+细胞能够上调主动脉IFN-γ、IL-17、MCP-1和VCAM-1 mRNA的含量，同时可下调TGF-β和IL-10 mRNA的含量。
　　结论： CD4+LAP+Tregs细胞是一类有别于Foxp3+Tregs的调节性T细胞。过继转输CD4+LAP+ Tregs细胞能够减轻动脉粥样硬化斑块形成和促进斑块稳定，其机制为CD4+LAP+ Tregs能够分泌大量抗炎因子TGF-β和IL-10，后者可抑制IL-17、MCP-1和IFN-γ的生成。

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中文摘要

英文摘要

前言

参考文献

第一部分CD4+LAP+调节性T细胞在动脉粥样硬化小鼠中数量与功能变化

材料及方法

结果

讨论

参考文献

附表

附图

第二部分去除CD4+LAP+调节性T细胞促进免疫炎症反应和小鼠动脉粥样硬化斑块形成

材料及方法

结果

讨论

参考文献

附表

附图

第三部分过继转输CD4+LAP+调节性T细胞减轻免疫炎症反应和小鼠动脉粥样硬化斑块形成

材料及方法

结果

讨论

参考文献

附表

附图

总论与创新

综述： 树突状细胞与动脉粥样硬化

附录 一 英文缩略词表及中文对照

附录 二 攻读博士学位期间主要发表的论文

致谢