线粒体内膜蛋白Mic60过表达对血管纹边缘细胞氧化应激损伤的作用

摘要

目的：探讨线粒体内膜蛋白Mic60过表达对大鼠内耳血管纹边缘细胞氧化应激损伤的作用。
　　方法：（1）取出生0-3天的新生SD大鼠耳蜗外侧壁血管纹组织进行原代培养，经纯化后的边缘细胞（MCs）在普通光学显微镜及免疫荧光显微镜下观察、鉴定。（2）50Um/ml葡萄糖氧化酶作用边缘细胞4hr后诱导MCs氧化应激模型，流式细胞仪检测细胞内的ROS水平。（3）免疫荧光及Western Blot观察Mic60在MCs中的表达及分布情况。用MCs感染预实验筛选出Mic60-GFP-Ad及GFP-Ad感染边缘细胞的合适滴度。（4）将体外培养的原代MCs根据不同的处理分为四组：C组即未经任何处理的对照组；GO组即葡萄糖氧化酶诱导建立的氧化应激模型组；Mic60-组即原代培养的MCs转染空载病毒GFP-Ad后再经葡萄糖氧化酶诱导的氧化应激模型组；Mic60+组即原代培养的MCs转染Mic60-GFP-Ad后再经葡萄糖氧化酶诱导的氧化模型组。（5）流式细胞仪上检测各组细胞内的ROS水平，Western Blot检测Mic60、SOD1、SOD2在MCs中的蛋白水平。
　　结果：（1）在普通光学显微镜下观察到MCs接种后培养24hr后贴壁生长，单层可融合形成典型的“铺路石”样外观，后期可见数个细胞重叠生长形成的“dome”样结构。在免疫荧光镜下观察检测到MCs上皮细胞特异性蛋白CK18表达呈阳性。（2）50Um/ml葡萄糖氧化酶作用边缘细胞4hr后，流式细胞仪上检测细胞内的ROS水平，发现实验组与对照组相比其细胞内的ROS水平显著上升（p<0.01）。（3）免疫荧光观察Mic60主要表达于细胞质，Western Blot结果表明Mic60在线粒体内表达。通过MCs感染预实验筛选出Mic60-GFP-Ad及GFP-Ad的合适滴度，分别为1.2×107 PFU/ml、1.0×107 PFU/ml。免疫荧光镜下观测到腺病毒转染MCs48hr后其表达较强且细胞状态较好。（4）流式细胞仪检测四组离体培养的MCs中ROS的水平，发现GO组、Mic60-组ROS水平较C组均升高（p<0.01）；但Mic60+组与Mic60-组相比较ROS水平显著降低（p<0.01）。（5）Western Blot检测各组Mic60、SOD1、SOD2在MCs线粒体中的蛋白表达，发现GO组、Mic60-组Mic60、SOD1、SOD2的蛋白表达水平较C组略有升高，但无统计学意义（p＞0.05）；Mic60+组Mic60、SOD2蛋白水平较Mic60-组显著升高（p<0.01），但SOD1表达上升不具有统计学意义（p＞0.05）。
　　结论：Mic60蛋白在大鼠内耳血管纹边缘细胞的线粒体内表达，Mic60的过表达可以降低MCs的ROS水平，这可能与边缘细胞线粒体内的抗氧化酶SOD2的蛋白水平升高具有一定的关系。