MARK2通过调节微管相关蛋白介导Nogo-66抑制轴突生长

摘要

目的：
　　Nogo-66抑制轴突生长的机制至今仍不完全清楚，关于MARK2（微管亲和力调节激酶2）在神经轴突生长中的作用研究也较少报道，MARK2是否参与Nogo-66抑制轴突生长尚未有研究报道。本实验旨在研究MARK2在Nogo-66抑制神经元轴突生长中的作用以及MARK2对轴突生长的作用机制，并且在脊髓损伤动物模型体内探讨MARK2基因对大鼠轴突再生的影响，为治疗脊髓损伤阻断髓鞘抑制提供一种最佳途径。
　　方法：
　　1.从Genbank中筛选MARK2基因，构建干扰MARK2表达的shRNA质粒和过表达MARK2的质粒。进行腺相关病毒包装，构建过表达 MARK2及干扰MARK2表达的腺病毒重组体，并进行基因测序验证。
　　2.传代培养N2a细胞，在5组细胞培养基中加入Nogo-66，保持15min、30min、6h、24h、48h的培养时间后，提取蛋白，利用western-blot法检测MARK2及p-Ser212(MARK2在Ser212位点磷酸化)蛋白表达量的变化。
　　3. N2a细胞分别感染两种不同的腺相关病毒MARK2-AAV、shRNA MARK2-AAV后，应用western-blot和免疫荧光法对MARK2-AAV、shRNA MARK2-AAV的表达效果进行鉴定。
　　4. N2a细胞感染MARK2-AAV、shRNA MARK2-AAV后，应用western-blot检测MARK2对于微管相关蛋白tau、p-S262 tau和MAP1-b表达量的影响。
　　5.体外原代培养大鼠皮层神经元细胞，根据转染病毒的不同（EGFP-AAV或MARK2-AAV）及培养基有无 Nogo-66（DMSO），将神经元分为4组：HK+DMSO,OE+DMSO,HK+Nogo-66,OE+Nogo-66。应用免疫荧光显微镜拍照、测量每组神经元轴突长度，进行统计学分析。
　　6.通过感染MARK2-AAV，在N2a细胞中过表达MARK2,应用western-blot和免疫荧光法检测N2a细胞内酪氨酸化和乙酰化α-微管蛋白的表达量变化。
　　7.采用24只成年雌性 SD大鼠脊髓全横断法建立大鼠脊髓损伤模型；根据脊髓损伤后处死时间的不同，分为6组：Control、SCI1d、SCI3d、SCI7d、SCI14d、SCI21d（每组4只），取出损伤区脊髓（正常对照组T8段脊髓），应用western-blot检测MARK2及p-Ser212表达量变化情况。
　　8.取16只成年雌性 SD大鼠，4只为正常对照，12只建立脊髓损伤模型；建模7天后根据感觉运动区皮层注射介质（Saline、EGFP-AAV、MARK2-AAV）的不同，随机分为3组：Saline、EGFP-AAV、MARK2-AAV（各4只）；建模14天后，在16只大鼠皮层相同位置注射BDA（神经示踪剂）。建模21天后处死所有大鼠,灌注甲醛。正常组取脑及脊髓，免疫荧光显微镜检测BDA标记的轴突在脑及脊髓中的走行；建模组取损伤区脊髓，应用免疫荧光显微镜检测BDA，了解轴突再生情况。
　　9.实验结果进行统计学分析并以means±SEMs表示，两组间的比较采用配对t检验，两组以上使用单因素方差分析（one way ANOVA或two way ANOVA）；由于检测目的及检测对象的不同，采用不同的方差后分析（Dunn’s posttests，Turkey posttests，Bonferroni posttest）；P<0.05被认为具有统计学意义。
　　结果：
　　1．干扰MARK2和过表达MARK2的腺病毒重组体经酶切鉴定、测序，证明设计序列与设计的目的基因相符，构建腺病毒重组体成功。
　　2．在加入Nogo-66不同时间后，总MARK2含量及MARK2在Ser212位点磷酸化程度发生了显著下降，方差后分析结果显示在24h和48h两个时间点MARK2及p-Ser212均显著降低（与对照组比较，P<0.05)。
　　3．免疫荧光和western-blot检测结果显示，MARK2-AAV能够显著提高MARK2表达量（与对照组相比，P<0.05)，shRNA MARK2-AAV能够显著降低MARK2蛋白表达量（与对照组相比，P<0.05)。
　　4.通过过表达MARK2或干扰MARK2表达，western-blot结果显示MARK2显著影响tau、p-S262 tau和MAP1-b的表达，呈明显正相关关系（P<0.05)。
　　5.体外原代培养皮层神经元细胞在对照组中（HK+DMSO组）轴突长度为68.4±12.3μm，加入Nogo-66（HK+Nogo-66组）后，轴突长度显著下降，为28.4±6.3μm(与对照组HK+DMSO组比较，P<0.05)；过表达MARK2（OE+DMSO组）后轴突长度显著增长，为117.4±22.6μm（与HK+DMSO组比较，P<0.05)；而经过MARK2-AAV预处理的神经元加入Nogo-66后（OE+Nogo-66组），能够明显减弱Nogo-66对轴突的抑制作用，轴突长度为66.8±9.4μm（与HK+Nogo-66组比较，P<0.05)。
　　6.过表达MARK2后检测酪氨酸化α-微管蛋白和乙酰化α-微管蛋白，结果显示MARK2-AAV显著提高酪氨酸化的α-微管蛋白水平(P<0.05)，乙酰化α-微管蛋白无明显变化。
　　7.在脊髓损伤后的不同时间取损伤区脊髓后，MARK2及p-Ser212蛋白表达水平在脊髓损伤区显著降低(与正常对照组比较，P<0.05)，证明脊髓损伤影响MARK2的表达及其磷酸化程度。
　　8.脑和脊髓矢状位切片结果显示，BDA被神经元吸收后在脑及脊髓中沿神经束下行传导；BDA示踪结果显示，MARK2-AAV组轴突最长可以达到600μm，而Saline、EGFP-AAV组只有450μm，MARK2-AAV组与其它两组比较有显著性差异(P<0.05)；在轴突增生的不同长度值中，在200μm，300μm，400μm点，BDA标记的轴突比例均要明显高于Saline、EGFP-AAV组(P<0.01)。
　　结论：
　　本研究结果表明，Nogo-66显著降低总MARK2蛋白表达及Ser212位点磷酸化程度，MARK2通过调控tau及MAP1-b参与Nogo-66的抑制信号通路；MARK2-AAV通过提高酪氨酸化α-微管蛋白水平促进轴突的生长；MARK2-AAV能够显著减弱Nogo-66对轴突生长的抑制作用。在脊髓损伤后，总MARK2及其在Ser212位点磷酸化程度均显著下降；在皮层的感觉运动区立体定向注射MARK2-AAV能够显著促进轴突生长。表明神经元内MARK2/MAPs/α-tubulin信号通路在Nogo-66-NgR调控轴中起着十分关键的作用，MARK2为神经系统损伤后的再生修复带来了希望。

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第一部分MARK2 在Nogo-66抑制轴突生长中作用的体外研究

前言

材料与方法

1．材料

2．实验方法

3．统计分析

结果

1、shRNA-MARK2测序鉴定结果

2、PEC-IRES-EGFP-MARK2(过表达MARK2质粒)鉴定结果

3、腺相关病毒包装鉴定结果

4、Nogo-66降低 N2a 细胞内总MARK2水平及在Ser212位点的磷酸化程度

5、皮层原代神经元的的鉴定及腺相关病毒感染情况

6、过表达及干扰MARK2表达的腺相关病毒效果鉴定

7、MARK2对微管相关蛋白的影响

8、MARK2与Nogo-66对神经元轴突生长的影响

9、MARK2对微管蛋白翻译后修饰的影响

讨论

1.MARK2的活性及调控因素

低了MARK2在Ser212位点磷酸化程度。因此我们推断，MARK2并不只受GSK-3β的调控，

2.MARK2与MAP

3.神经元微管结构

4.MAP对微管的调节

5.微管蛋白翻译后修饰

6.Nogo-66与MARK2 的信号通路

结论

参考文献

第二部分MARK2在脊髓损伤后对轴突再生作用的体内研究

前言

材料与方法

1．材料

2．实验方法：

3．统计分析

结果

1、SCI动物模型的建立

2、SCI后MARK2水平及其在Ser212位点磷酸化程度的变化

3、立体定向注射BDA标记神经元轴突的传导

4、过表达MARK2促进脊髓损伤区神经轴突再生

讨论

1.SCI后体内环境变化

2.SCI后修复与再生的影响因素

3.SCI后轴突再生策略

4.再生和发芽

5.研究的局限性

结论

参考文献

综述: 脊髓损伤后神经再生策略

论文主要创新点

博士期间发表文章情况

致谢