脱氧雪腐镰刀菌烯醇的胚胎毒性及胎盘氧化应激所起作用

摘要

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）是粮谷类食物重要的污染物之一，其在大麦、小麦、玉米以及其他谷类作物中含量最高，而农副产品（如啤酒、面包、鸡蛋、牛奶和肉类等）中也有检出。DON是单端孢霉烯族化合物B型中的一员，该族化合物已被证实由食物与环境中的镰刀菌、葡萄穗霉菌以及漆斑菌等在生长过程中产生，并且其引起的食物中毒事件一直是全球食品安全工作者关注的重点之一。DON很难被一般的烹调和加热降解，即其毒性在一般情况下很难被破坏，因此其在食品和环境中具有极高的残留浓度，一旦形成将通过食物链的传递对人体和动物的健康产生巨大威胁。
　　就目前的研究来看，DON可在多个物种体内引起多器官的损伤，主要表现为恶心、呕吐、拒食、腹泻、消化紊乱以及体重减轻等相对较轻微的反应，也可引起皮肤损伤，免疫抑制甚至骨髓破坏等严重不良反应。从另一方面来说，DON在体内无特殊的靶器官，但具有很强的细胞毒性。同时DON具有多种生物毒作用，主要包括细胞毒性，免疫毒性，遗传毒性，以及致畸性和致癌性等。近年来在体内和体外模型上，DON被发现具有影响不同动物和细胞繁殖和胚胎发育的特征，猪和鼠是应用广泛的体内实验研究对象，而BeWo细胞和卵母细胞则是重要的体外实验研究对象。虽然DON的胚胎发育毒性已被众多研究所证实，但是其毒性作用机制仍需更深入的探讨，而这一点将是本研究的重点之一。
　　早期的实验已证实细胞内ROS过度堆积所引起的氧化应激是DON引起早期毒作用的重要机制之一。本研究将关注该毒作用机制是否存在于DON诱导胎盘氧化损伤的模型中。胎盘（placenta）是母体与胎儿进行物质交换的器官，胎儿在子宫中仅能依靠胎盘从母体获得营养。HO-1是血红素代谢的关键酶，其表达上调对于细胞来说是自我保护的适应性机制之一，即一定程度上保护细胞免于各种因素引起的氧化损伤。就本实验来说，一方面HO-1广泛分布于全身（包括子宫和胎盘）组织细胞的微粒体内，能被多种刺激因素（如低氧状态、内毒素及紫外线照射等）引起的氧化应激诱导表达，这是机体抵抗氧化损伤的重要机制之一。另一方面HO-1的缺陷将导致多种妊娠不良结局的出现（如复发性流产、宫内发育迟缓、死胎和先兆子痫等）。因此，我们认为HO-1可作为本研究的效应标志物，同时探讨其相关信号通路，即Nrf2/HO-1信号转导通路，在该过程中的表达情况也是本研究的关注点之一。
　　综上所述，本课题一方面可确证DON所致胚胎发育毒性，另一方面将深入分析DON引起胚胎发育毒性的分子机制。因此，该课题的完成将对DON发育毒性的早期预警和风险评估基础资料的建立起到不可或缺的作用。
　　第一部分妊娠期脱氧雪腐镰刀菌烯醇暴露对C57BL/6小鼠胚胎毒性研究
　　目的：对妊娠期DON染毒C57BL/6小鼠在妊娠末期进行胚胎发育评价，确证DON具有胚胎毒性，同时初步分析DON致胚胎毒性的特点。
　　方法：小鼠适应性喂养1w后以2:1的比例将雌雄小鼠合笼，次日以查见阴栓者（查出精子）定为妊娠0.5 d（Gestation day0.5 d，GD0.5 d）。按体重将怀孕母鼠随机分为4组后在母鼠GD9.5-11.5 d分别给予不同剂量DON溶液连续灌胃染毒。具体分组情况如下：（1）阴性对照组（Control）：超纯水；（2）DON低剂量组（DON-L）：1.0 mg/kg/day；（3）DON中剂量组（DON-M）：2.5 mg/kg/day；（4）DON高剂量组（DON-H）：5.0 mg/kg/day。GD18.5 d将母鼠颈椎脱臼处死，分离子宫观察胎盘和胚胎。观察外形的同时进行骨骼和内脏的染色以确定是否存在相应畸形，同时计算与胚胎发育相关各指标的数值并进行统计分析。
　　结果：（1）妊娠期DON暴露对母鼠的影响：DON对妊娠期母鼠引起的拒食和体重减轻等作用不明显。各组母鼠的胎窝总重，胎盘总重和平均胎盘重未出现显著性差异（P>0.05）；
　　（2）妊娠期DON暴露对胚胎的影响：高剂量组的活胎率和吸收胎率与对照组相比具有显著性差异（P<0.01），且高剂量组多只母鼠均出现全吸收胎的情况。DON对小鼠胚胎发育的影响可能并不表现在外观和内脏畸形方面，而是表现在骨骼畸形方面，且全身各处骨骼均可检出明显的畸形。
　　结论：（1）初步证实DON具有胚胎毒性，且GD9.5-11.5 d时5.0 mg/kg DON暴露主要导致吸收胎，而2.5 mg/kg DON暴露对胚胎的影响则主要表现为骨骼畸形，另外1.0 mg/kg DON对母鼠和胚胎的影响未被观察到；
　　（2）DON暴露引起的骨骼畸形分布于全身，如头颈部，中轴骨，锁骨和四肢骨骼均可检出明显的畸形，而其中尾部畸形（卷尾）的发生率最高。
　　第二部分妊娠期脱氧雪腐镰刀菌烯醇暴露对C57BL/6小鼠胎盘氧化应激的影响
　　目的：观察妊娠期DON暴露时胎盘氧化应激水平和Nrf2/HO-1信号转导通路表达水平。探讨DON诱导胎盘氧化应激在DON所致胚胎毒性中的角色，同时初步探讨HO-1在此过程中所起作用。
　　方法：小鼠适应性喂养1w后以2:1的比例将雌雄小鼠合笼，次日以查见阴栓者（查出精子）定为GD0.5 d。按体重将怀孕母鼠随机分为4组后在母鼠GD9.5-11.5 d分别给予不同剂量DON溶液连续灌胃染毒。具体分组情况如下：（1）阴性对照组（Control）：超纯水；（2）DON低剂量组（DON-L）：1.0 mg/kg/day；（3）DON中剂量组（DON-M）：2.5 mg/kg/day；（4）DON高剂量组（DON-H）：5.0 mg/kg/day。GD18.5 d将母鼠颈椎脱臼处死后进行后续实验。将胎盘组织固定并进行H&E染色，检测胎盘组织ROS水平的同时对氧化和抗氧化指标（MDA，SOD，GSH）水平进行分析。此外，PCR和WB检测信号转导通路Nrf2/HO-1相关基因mRNA和蛋白表达水平的同时使用ELISA的方法测定胎盘组织中HO-1的酶水平。另外，采用激光共聚焦法来测定细胞中Nrf2的转位。最后，初步探讨炎症和凋亡相关基因在此过程中的表达水平。
　　结果：（1）DON对胎盘的结构和功能均具有损伤作用，在中剂量和高剂量组尤为明显；
　　（2）妊娠期DON暴露会引起胎盘ROS聚集，该现象在DON剂量为5.0 mg/kg/day时较为明显。高剂量组MDA水平显著高于对照组（P<0.01）。低、中剂量组与对照组相比SOD水平显著性上升（P<0.05），且具有剂量效应，而高剂量组未出现显著性改变。然而，3个DON处理组与对照组相比GSH水平均无显著性差异；
　　（3）3个DON处理组PIGF的mRNA表达水平均显著性低于对照组（P<0.05），而以上3组的蛋白质水平虽均低于对照组，但仅高剂量组与对照组相比差异具有显著性（P<0.01）；
　　（4）3个DON处理组HO-1酶水平均低于对照组，但从低剂量组到高剂量组表现出上调趋势，其中低剂量组和中剂量组与对照组相比差异具有显著性（P<0.05）；
　　（5）HO-1的mRNA在低剂量组显著性高于对照组（P<0.05），而高剂量组显著性低于对照组（P<0.01），而Nrf2的mRNA在低剂量组和中剂量组均显著性高于对照组（P<0.05）。HO-1的蛋白表达在中剂量组（P<0.01）和高剂量组（P<0.05）均显著性高于对照组，而Nrf2的蛋白表达在低剂量组（P<0.05）、中剂量组（P<0.05）和高剂量组（P<0.01）均显著性高于对照组。Keap-1的蛋白表达未出现显著性改变。同时在该过程中胎盘中Nrf2由细胞质向细胞核中转位的现象可被观察到；
　　（6）炎症相关指标IL-6，IL-8，TNF-α和Cox-2的mRNA表达在3个DON处理组表现得颇为复杂，具体情况为低剂量组中发现TNF-α表达显著性上调（P<0.05），中剂量组Cox-2表达显著性下调（P<0.05），而高剂量组则是IL-6显著性下调（P<0.05）而IL-8显著性上调（P<0.05）。
　　结论：（1）妊娠期母鼠DON暴露将对母鼠胎盘产生结构和功能上的双重损伤；
　　（2）胎盘结构和功能的损伤可能与DON引起的胎盘氧化应激相关，炎症和凋亡也在该过程中出现，但其具体变化情况仍需进一步研究；
　　（3）胎盘中Nrf2/HO-1信号转导通路在DON发挥胚胎毒性过程中发生表达改变，并可能起到保护胎盘和胚胎发育的作用。
　　第三部分脱氧雪腐镰刀菌烯醇染毒对BeWo细胞毒性分子机制研究
　　目的：对BeWo细胞给予不同剂量的DON染毒，同时结合HO-1激活剂（Hemin）和抑制剂（Znpp），探讨DON染毒导致的氧化应激反应对该细胞的影响。另外，验证HO-1在DON染毒时在BeWo细胞中表达的时间-和剂量-效应关系。
　　方法：复苏细胞后在培养基中进行培养，每日观察细胞的生长和贴壁状况，当细胞融合程度达到80％时即可进行细胞传代。而后按实验要求将细胞接种到所需器皿上（如12孔板，96孔板或培养皿等），接种后保持隔天换液。使用CCK-8试剂盒进行细胞活力检测，确定具体的分组：（1）阴性对照组：0 nM DON；（2）DON处理组：50 nM DON；（3）HO-1激活剂组：50 nM DON+10μM Hemin；（4）HO-1抑制剂组：50 nM DON+10μM Znpp。按以上分组培养1 h（仅PCR），3 h，12 h和24 h后进行后续实验。使用ELISA试剂盒分别测定细胞分泌β-HCG的水平和HO-1的酶水平。多功能酶标仪被用来测定细胞内ROS水平，此外运用不同的试剂盒测定细胞中MDA, SOD和GSH水平。PCR检测信号转导通路Nrf2/HO-1相关基因mRNA的表达水平。另外，采用激光共聚焦法来测定细胞中Nrf2的转位。最后，PCR初步分析炎症和凋亡相关基因mRNA在此过程中的表达水平。
　　结果：（1）所有DON处理组β-HCG水平均显著性低于对照组（P<0.01），在3 h和12 h时HO-1激活剂和抑制剂组与50 nM DON处理组相比均无显著性差异，而在24 h时以上两组β-HCG水平均显著性低于50 nM DON处理组（P<0.05）；
　　（2）DON处理时细胞发生显著的ROS堆积（P<0.01），而HO-1激活剂能显著性改善DON处理引起的ROS堆积（P<0.01）。3 h时HO-1激活剂和抑制剂组MDA水平均显著性高于DON处理组（P<0.01），但在12 h时HO-1激活剂组变为显著性低于DON处理组（P<0.05）。Hemin在3 h表现为升高SOD水平（P<0.05），但此后均显著性下调SOD水平（P<0.01），而Znpp仅在12 h表现为显著性上调其水平（P<0.01）。Hemin在3 h显著性下调GSH水平（P<0.01），而Znpp则在24 h显著性上调GSH水平（P<0.01）；
　　（3）3 h时Hemin和Znpp分别表现出相应的上调和下调HO-1酶水平的作用（P<0.01），12 h时3个DON处理组无显著性差异，24 h时Hemin和Znpp均表现为上调HO-1水平（P<0.01）；
　　（4）Hemin和Znpp在各时间点均升高HO-1的mRNA表达水平（P<0.01），Hemin仅上调3 h时Nrf2的表达（P<0.05），而Znpp上调12 h和24 h时Nrf2的mRNA表达（P<0.01）。此外，Hemin和Znpp预处理的BeWo细胞在较长时间DON处理（如12 h和24 h）时，Nrf2将出现明显的从细胞质向细胞核转位的过程；
　　（5）随着DON处理时间和剂量的增加，细胞炎症反应不断增强，各炎症因子表达趋势较为复杂。
　　结论：（1）早期DON处理时，HO-1激活剂改善DON导致的细胞功能障碍，而随着时间的进展，HO-1激活剂的该功能逐渐失效，反而是HO-1抑制剂起到更有效的改善功效；
　　（2）ROS水平对DON染毒时的胎盘滋养层细胞中HO-1的表达存在时间-和剂量-效应关系；
　　（3）胎盘氧化应激是DON产生胚胎毒性的机制之一，激活HO-1的活性在早期可上调细胞的抗氧化能力，但随着时间的推移该作用逐渐消失，甚至HO-1过度激活将会加重细胞的氧化损伤，即HO-1对氧化应激的保护作用存在“阈值效应”。

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前言

第一部分 妊娠期脱氧雪腐镰刀菌烯醇暴露对C57BL/6小鼠胚胎毒性研究

1. 材料和方法

2. 结果

3. 讨论

第二部分 妊娠期脱氧雪腐镰刀菌烯醇暴露对C57BL/6小鼠胎盘氧化应激的影响

1. 材料和方法

2. 结果

3. 讨论

第三部分 脱氧雪腐镰刀菌烯醇染毒对BeWo细胞毒性的分子机制研究

1. 材料和方法

2. 结果

3. 讨论

结论

本研究创新之处

后续研究

参考文献

综述: T-2毒素和脱氧雪腐镰刀菌烯醇在动物和人体内的代谢及相关

附录1攻读博士学位期间参与科研项目及学术会议

附录2攻读博士学位期间发表论文

致谢