CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞在自身免疫性肝炎中的作用研究

摘要

目的：
　　CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞（Regulatory T cell, Treg）是一类具有免疫抑制功能的T细胞亚群，在保持对自身抗原和外来抗原耐受方面具有极其重要的作用。许多研究发现，Treg细胞数量及功能的缺陷参与了多种自身免疫性疾病的发生发展。本研究旨在利用人Ⅱ型自身免疫性肝炎（Autoimmune hepatitis，AIH）的主要自身抗原——细胞色素P4502D6（Cytochrome P4502D6，CYP2D6)免疫C57BL/6小鼠，建立Ⅱ型AIH小鼠模型（CYP2D6小鼠模型），同时收集AIH患者外周血标本，观察Treg细胞数量的变化及其功能性分子的表达情况，探讨Treg细胞在AIH疾病进展中的作用。
　　方法：
　　前期研究已成功构建携带人CYP2D6目的基因的非复制型腺病毒（Ad-2D6）及不含CYP2D6的空白对照（Ad-GFP）。将Ad-2D6通过腹腔及静脉途径同时免疫C57BL/6小鼠，建立CYP2D6小鼠模型，平行设立 Ad-GFP免疫对照组。如下方法评估模型的建立情况：
　　（1）免疫小鼠后1W、2W、3W、4W、6W、8W分别取肝组织行HE染色动态观察肝脏病理学改变；免疫小鼠后1W，取肝组织免疫组织化学染色方法检测肝细胞内CYP2D6抗原的表达情况；免疫小鼠后1W、2W、3W、4W、6W、8W分别收集血清，酶联免疫吸附法检测IgG的滴度；间接免疫荧光法检测血清中特异性自身抗体——抗CYP2D6抗体的表达。
　　（2）流式细胞术动态检测模型组及对照组小鼠脾脏、肝脏及外周血 Treg细胞的频数及绝对计数；提取肝组织RNA，Real time qPCR技术检测影响Treg细胞分化及功能的关键转录调控蛋白FOXP3的mRNA相对表达水平；评价肝内Treg细胞抑制性功能分子CD39、TIGIT的表达情况
　　（3）流式细胞术检测AIH患者外周血Treg细胞的频数变化及其抑制性功能分子CD39、TIGIT的表达情况。
　　结果：
　　（1）成功建立CYP2D6小鼠模型。与对照组小鼠相比，模型小鼠肝细胞内成功表达CYP2D6抗原；肝组织呈现界面性肝炎样炎性损伤，即汇管区、中央静脉周围可见不同程度的淋巴细胞浸润，炎症始于汇管区并侵入肝实质，引起周围肝细胞坏死；模型小鼠血清总IgG滴度明显升高、血清特异性自身抗体阳性表达，成功模拟了人Ⅱ型AIH的主要临床特点。
　　（2）免疫后1W至第8W，与对照组相比，CYP2D6模型组小鼠肝脏内Treg细胞的比例及绝对计数均明显减少（P<0.05）。外周血及脾脏中Treg的频数在两组间无差别。
　　（3）免疫后1W、4W及6W，与对照组相比，CYP2D6模型组小鼠肝脏FOXP3 mRNA相对表达水平明显降低（P<0.05）。
　　（4）免疫后1W及2W，与对照组相比，模型组小鼠肝脏TIGIT+Treg细胞的比例明显升高（P<0.05），Treg细胞表达TIGIT的平均荧光强度也明显增强（P<0.05）。至免疫后6W，模型组小鼠肝脏TIGIT+Treg细胞的比例显著低于免疫后1W水平（P<0.05）。
　　（5）AIH患者外周血Treg的频数与健康对照组相比无差别，但是其TIGIT+Treg细胞的比例明显低于对照组（P<0.001）。
　　（6）结合AIH患者的疾病进展行分层分析，发现进展为肝衰竭的AIH患者的Treg频数显著低于未进展为肝衰竭患者的水平（P<0.01）。
　　结论：
　　（1）成功建立Ⅱ型AIH小鼠模型——CYP2D6小鼠模型，为进一步研究AIH的免疫学发病机制提供了有力的工具。
　　（2）肝脏内Treg细胞数量的显著减少可能是CYP2D6小鼠模型发生AIH的原因之一。
　　（3）针对肝脏Treg细胞数量的减少，CYP2D6模型小鼠在病程早期可通过促进Treg细胞代偿性高表达TIGIT活化分子以弥补其负性调控功能的不足，但随着疾病进展，最终代偿机制失败，导致了AIH的发生。
　　（4）进展为肝衰竭的AIH患者其外周Treg细胞频数显著下降，提示Treg细胞的下降程度与AIH疾病的进展密切相关。

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引言

第一部分 建立II型自身免疫性肝炎小鼠模型

材料与方法

1.1实验动物

1.2实验仪器设备

1.3主要实验试剂及来源

1.4常用溶液的配置

2.实验方法

2.1动物模型的建立及标本的获取

2.2 CYP2D6模型小鼠肝组织病理学改变

2.3CYP2D6抗原的表达

2.4血清中自身抗体的表达

2.5血清免疫球蛋白的检测

2.6统计学方法

3.结果

3.1 CYP2D6小鼠模型肝组织呈现界面性肝炎样炎性损伤

3.2 CYP2D6抗原在CYP2D6小鼠模型肝细胞内的表达

3.3 CYP2D6小鼠模型血清免疫球蛋白IgG滴度明显升高

3.4 CYP2D6小鼠模型血清中自身抗体阳性表达

讨论

第二部分 调节性T细胞在自身免疫性肝炎中的作用研究

材料与方法

1.1实验动物

1.2自身免疫性肝炎患者病例资料

1.3实验仪器设备

1.4主要实验试剂及来源

1.5常用溶液的配置

2.实验方法

2.1CYP2D6小鼠模型的建立及标本获取

2.2小鼠外周血胞内因子染色

2.3小鼠脾脏淋巴细胞的分离

2.4小鼠肝脏淋巴细胞的分离

2.5小鼠肝脾淋巴细胞胞内因子染色

2.6小鼠肝脏总RNA的提取

2.7 RNA浓度的测定

2.8逆转录反应（总体积20ul）

2.9 Real-time Quantitative PCR引物序列

2.10 Real-time qPCR检测FOXP3 mRNA的相对表达水平

2.11人外周血Treg细胞流式检测

2.12统计学方法

3.结果

3.1 CYP2D6小鼠模型肝脏Treg细胞数量显著下降

3.2 CYP2D6小鼠模型肝组织中FOXP3的表达明显降低

3.3 CYP2D6小鼠模型肝脏内TIGIT+Treg 、CD39+Treg细胞的表达变化

3.4 自身免疫性肝炎患者资料

3.5 自身免疫性肝炎患者外周血Treg细胞及其CD39+Treg、TIGIT+Treg亚群频数表达变化

讨论

展望：

参考文献

综述: 调节性T细胞在自身免疫性肝炎中的研究进展

英文缩略词对照表

致谢