脂肪干细胞来源的外来体促进皮肤创伤愈合的研究

摘要

目的：
　　软组织创伤的经久不愈和愈合后的瘢痕形成是临床两大难点，也是研究热点。最新研究发现间充质干细胞来源的外来体（exosomes）在创伤愈合中发挥积极作用。然而，脂肪干细胞（ASCs）来源的exosomes在皮肤创伤修复中的作用及机制尚不清楚。本研究探讨ASCs来源的exosomes对皮肤创伤愈合的主要效应细胞－成纤维细胞的生物学性能的影响，为促进软组织创伤愈合以及提高修复质量提供理论依据，也为临床应用提供新思路。
　　方法：
　　（1）构建小鼠背部和腹股沟相同大小创伤模型，比较有脂肪层的腹股沟创口和无脂肪层的背部创口愈合快慢，并且创口组织免疫荧光检测exosomes标志蛋白CD63的表达情况；
　　（2）从人脂肪间充质干细胞培养液中提取出ASCs分泌的exosomes，采用透射电镜，Nanosigtht，Western blot三种方法分别对其进行形态学，直径分布，蛋白组学的鉴定；
　　（3）将用CM-DiI荧光染料标记过的exosomes加入到成纤维细胞的培养液，24h后荧光显微镜下观察exosomes是否进入到成纤维细胞里，参与调控成纤维细胞的生物学行为；
　　（4）用不同浓度的exosomes（0,25,50,100ug/ml）刺激成纤维细胞，利用划痕实验和Transwell实验检测exosomes对成纤维细胞的迁移能力的影响，CCK-8法检测对成纤维细胞增殖能力和RT-PCR法检测对胶原合成的影响；
　　（5）构建小鼠背部创伤模型，将DIR荧光染料标记的exosomes通过鼠尾静脉注射到小鼠体内，活体成像仪检测exosomes是否迁移到创口部位，参与创伤愈合过程；
　　（6）采用Masson染色评估创口总体胶原纤维的表达情况，免疫组化检测创口Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达情况，RT-PCR检测创口Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA合成情况，同时计算创口愈合率。
　　结果：
　　（1）发现含有脂肪组织的腹股沟部位创伤愈合更快，外来体标志蛋白CD63免疫荧光结果显示在该部位细胞分泌了更多的外来体，发现脂肪组织对创伤愈合的积极影响，这提示可能跟exosomes有关。
　　（2）通过透射电镜的检测显示提取的粒子是圆形的囊泡样结构并且呈现典型的“杯口状”，粒子的直径大小约85％集中分布在30-100nm之间。同时，利用NanoSight仪器动态的观察了外来体（exosomes）的直径大小，浓度的检测，以及布朗运动轨迹和动态追踪视频截图，结果表现出和透射电镜相似的实验结果。通过蛋白免疫印迹法显示提取出的粒子高表达外来体标志蛋白CD63和CD9。
　　（3）体外示踪实验显示exosomes可以进入到成纤维细胞胞浆里，提示exosomes可以被成纤维细胞摄取。
　　（4）exosomes对成纤维细胞的迁移，增殖具有明显的促进作用，且具有浓度依赖性；exosomes可以显著上调成纤维细胞的Ⅰ、Ⅲ型胶原和弹性蛋白的表达，尤其是在50ug/ml这个浓度的作用最明显。
　　（5）体内示踪实验发现exosomes可以迁移到创口周围。
　　（6）exosomes可以明显促进创伤愈合，并且在伤口愈合早期Ⅰ、Ⅲ型胶原表达增多，而在愈合后期Ⅰ、Ⅲ胶原表达减少。
　　结论：
　　脂肪干细胞来源的exosomes可以优化成纤维细胞的生物学性能，促进了成纤维细胞的迁移，增殖能力，调控胶原合成，有助于缩短皮肤创伤愈合时间、减少瘢痕形成，提高创伤愈合质量。本实验为临床皮肤软组织损伤治疗提供一种新的思路。