基于CRISPR/dCas9系统的Rapamycin调控下的转录激活系统

摘要

目的:靶向特定位点的基因激活对于了解复杂的基因网络、发现基因的上下游调控因子、构建动物模型、治疗疾病、医疗以及工业上应用都具有很大意义。通过构建在rapamycin诱导下，时间空间上调控特定靶基因表达的系统，我们可以精确调控靶基因在特定时期的表达程度；构建相关动物模型；通过诱导抑癌基因表达上调，可以治疗恶性肿瘤性疾病，为肿瘤治疗的临床转化研究夯实基础。
　　方法:我们分别构建了靶向多个基因的sgRNAs、PSL690-dCas9-FKBP质粒（简称dCas9-FKBP，anchor质粒）、PSL690-FRB-effector domain（简称FRB-effector domain， activator质粒）。将sgRNA、anchor质粒和activator质粒共同转染293FT细胞，在rapamycin诱导下，FKBP和FRB结合，sgRNA牵引着转录因子VP64促进下游基因mRNA表达。提取细胞基因组RNA，逆转录，使用实时荧光定量PCR（Realtime-PCR）法检测dCas9-FKBP和FRB-VP64系统上调靶基因表达效应；加入不同浓度（0 nM、100 nM、200 nM、500 nM、1000 nM和2000 nM）rapamycin,使用CCK-8法检测加入rapamycin1d,2d,3d,4d后，该药物对293FT细胞的毒性；为了提高dCas9-FKBP和FRB-VP64系统上调基因表达的能力，我们将FRB-VP64进行改造，构建了FRB-p65、FRB-p65-VP64和FRB-VP64-VP64。将anchor质粒和activator质粒单独转染293FT细胞，Western blotting检测质粒基础表达量；又设计了靶向多个基因的sgRNA，转染人宫颈癌HeLa细胞，Realtime-PCR检测相应靶基因在HeLa细胞中的表达程度。
　　结果:Realtime-PCR检测结果发现，dCas9-FKBP和FRB-VP64组成的系统可以靶向上调VEGFA、IL1RN和ASCL1靶基因mRNA表达含量；CCK-8实验检测不同浓度rapamycin对293FT细胞的毒性，发现100 nM、200 nM、500 nM、1000 nM和2000 nM rapamycin对于细胞生长增殖能力没有影响；将activator质粒进行改造，使anchor质粒dCas9-FKBP重新与activator质粒FRB-p65、FRB-p65-VP64和FRB-VP64-VP64分别配对，分别比较这几个系统上调基因mRNA表达量效果，Realtime-PCR检测发现dCas9-FKBP和FRB-VP64-VP64配对的系统上调基因表达效果最好；将此系统应用到HeLa细胞中，能够靶向上调多个基因（bak1、Caspase9、bim和Bad）mRNA水平。
　　结论:成功构建了能够上调靶基因mRNA水平的dCas9-FKBP和FRB-VP64、FRB-p65、FRB-p65-VP64、FRB-VP64-VP64 anchor和activator质粒；Realtime-PCR检测发现anchor+activator系统可以特异性上调靶位点mRNA表达水平；dCas9-FKBP和FRB-VP64-VP64系统上调mRNA表达水平能力最强；靶基因mRNA表达上调与anchor质粒和activator质粒本身表达水平无关；dCas9-FKBP和FRB-VP64-VP64系统可以在293FT细胞以外的其他细胞中应用，具有广泛适用性。

目录

声明

华中科技大学博士学位论文创新点概述

前言

材料与方法

实验材料

实验方法

实验结果

（一）、在rapamycin作用下dCas9-FKBP+FRB-VP64系统上调VEGFA基因表达

（二）、优化改进dCas9-FKBP+FRB-VP64系统

（三）、进一步优化Cas9-FKBP+FRB-VP64系统

（四）、以上四个系统上调靶基因表达量与骨架质粒本身表达含量无关

（五）、dCas9-FKBP+FRB-VP64-VP64系统在其他细胞中也可促进基因表达上调

讨论

附表1 文章中用到的sgRNA序列

附表2 文中用到的RT-PCR引物序列

附件3 文章中构建的载体及相关片段的DNA序列

参考文献

综述：基因编辑工具治疗病毒感染和病毒感染相关肿瘤性疾病

摘要

引言

基因编辑工具的发生发展

基因编辑工具治疗病毒感染目前取得的进展

基因编辑工具用于临床转化目前仍存在的问题

结论

参考文献

致谢

附录1（攻读学位期间发表论文目录）