MiRNA-324-5p通过抑制SCFβ-TrCPE3泛素连接酶抑制多发性骨髓瘤的转移和侵袭

摘要

本文主要从以下几方面展开论述：
　　第一部分：MM细胞中miR-324-5p的表达及其对泛素化信号通路的影响
　　目的：伴del(17p)的MM在RISS临床危险分层中为高危组，且该组患者的治疗效果及预后较差，但是del(17p)在MM疾病进展中的作用机制仍不清楚。MiR-324-5p定位于17p13.1，已有多个研究结果研究表明miR-324-5p发挥抗肿瘤作用，其表达的异常减低与肿瘤细胞增殖分化、转移侵袭能力有关；然而在另一部分肿瘤中miR-324-5p表达增高与肿瘤的发生有关；在MM中miR-324-5p的表达水平及其作用尚属未知。UPS对MM细胞内正常生理活动的平衡有重要意义，且临床治疗中蛋白酶体抑制剂和免疫调节药均通过干扰UPS产生抗MM作用。故本实验拟检测评估MM患者和多种MM细胞系中miR-324-5p的表达状态，分析其与MM疾病分期的相关性并预测miR-324-5p在UPS中的作用。
　　方法：收集就诊于我院的26名初治MM患者和2名健康供者的骨髓血，利用Ficoll-Hyaque密度梯度离心法从中分离单个核细胞，再以CD138+磁珠从单个核细胞中分离浆细胞，浆细胞纯度经流式分析皆达95％以上。根据MM的RISS标准对所有MM患者进行危险分级。用含10%FBS的RPMI1640培养六种MM细胞系（NCI-H929、OPM-
　　2、U266、RPMI8226、MM.1R和MM.1S）。以TRIzol裂解细胞后从中提取总RNA，然后用TaqMan RT-PCR检测MM患者、MM细胞系及健康供者中的miR-324-5p的表达。分析MM患者中miR-324-5p的表达与RISS危险分级的相关性，比较MM细胞系和健康供者浆细胞中miR-324-5p表达的差异。选择miR-324-5p表达量较低的细胞系--MM.1R进行miR-324-5p mimic和miR-324-5p mimic negative control(mimic-NC)的转染实验，收集转染后48h的细胞沉淀，以TRIzol裂解细胞并将该样本以低温保存的方式委托给上海英拜生物公司进行泛素化信号通路PCR芯片检测。
　　结果：初治MM患者中miR-324-5p的表达水平随患者危险分级的增加而减低，且RISS-III级的MM患者miR-324-5p的表达明显低于RISS-I级的患者（P<0.05）。六种MM细胞系中miR-324-5p的表达均不同程度地低于健康供者。MM.1R细胞系中miR-324-5p的高表达时细胞内蛋白的泛素化水平被减低且泛素化信号通路PCR芯片检测发现了5个泛素化相关的基因（BTRC、DZIP3、HECW2、UBR2和VHL）表达减低而仅有一个基因（CBL）表达升高，其中BTRC被减低得最为显著（Fold：-2.42）。
　　结论：MM细胞中miR-324-5p的异常表达可能通过调节泛素化信号通路中相关基因的表达从而在MM疾病进展中发挥重要作用。
　　第二部分：miR-324-5p通过抑制SCFβ-TrCP E3泛素连接酶抑制MM细胞的转移与侵袭
　　目的：β-TrCP（beta-transducin repeat containing protein;protein of gene BTRC）是SCFβ-TrCP E3泛素连接酶复合物的识别亚基，它能选择性识别并泛素化靶蛋白从而使靶蛋白被蛋白酶体降解，由此它能参与调控细胞内的多种信号通路。小鼠MM细胞5TGM1的β-TrCP发生突变时，该细胞可发生自发的凋亡或死亡，且β-TrCP的抑制剂PDTC可减轻荷骨髓瘤小鼠的肿瘤负荷，故我们推测β-TrCP可能同样也参与了人类MM的发生和进展。已有研究证明β-TrCP通过识别靶蛋白氨基序列（降解决定子）--DSGxxS/T来使蛋白泛素化，而包含DSGxxS/T氨基的序列的MTSS1为其靶蛋白，MTSS1与肿瘤转移和侵袭有关，β-TrCP/MTSS1在MM的作用尚属未知。第一部分结果表明MM细胞中miR-324-5p高表达可减少细胞内泛素化信号通路中部分基因的表达，以BTRC最为显著。此部分实验将为验证miR-324-5p与β-TrCP/MTSS1表达的关系及对MM细胞生理活动的影响。
　　方法：体外培养多种MM细胞系，并以健康供者浆细胞作为正常对照，提取细胞内总RNA和总蛋白后，分别用SYBR Green RT-PCR和Western Blot技术检测MM细胞中BTRC、MTSS1的mRNA和蛋白的表达。用GraphPad Prism5.0软件分析miR-324-5p、β-TrCP和MTSS1表达的相关性。用miR-324-5p mimic转染MM.1R和H929细胞系以增加miR-324-5p的表达，培养48h-96h后检测细胞中BTRC、MTSS1表达的改变，同时用miR-324-5p mimic negative control（mimic-NC）转染这两个细胞作为阴性对照。收集转染了miR-324-5p mimic和mimic-NC并培养48h的MM.1R细胞进行增殖、Transwell迁移和侵袭实验，分析miR-324-5p高表达时MM细胞增殖、迁移与侵袭能力的改变。此外，用蛋白酶体抑制剂MG132处理MM.1R和H929细胞系并检测β-TrCP和MTSS1的表达改变。
　　结果：与健康供者相比，六种MM细胞系中β-TrCP呈显著高表达，且与miR-324-5p的表达负相关（r=-0.374）；而MTSS1则为不同程度低表达。统计学分析发现，BTRC mRNA的表达与miR-324-5p的表达呈负相关（r=-0.374）。同时，BTRC与MTSS1的表达在mRNA和蛋白水平上也呈负相关（r=-0.538；r=-0.678）；MM.1R和H929细胞系中miR-324-5p过表达时BTRC mRNA和蛋白的表达水平显著性降低（P=0.0153；P=0.0111），与此同时，MTSS1的表达在mRNA及蛋白水平显著性增高（P=0.0026；P=0.0386）。蛋白酶体抑制剂MG132可减少细胞内的β-TrCP而提高MTSS1，且呈浓度依赖趋势。此外，MM.1R细胞内miR-324-5p过表达时，其细胞增殖（P=0.0172）和迁移能力（P=0.0356）明显受抑。
　　结论：miR-324-5p可能通过抑制泛素化信号通路来抑制MM细胞的迁移和侵袭能力，从而发挥其抗肿瘤作用。

目录

声明

中英文缩略词表

前言

参考文献：

第一部分 MM细胞中miR-324-5p的表达及其对泛素化信号通路的影响

引言

材料和方法

结果

讨论

参考文献：

第二部分 MiR-324-5p通过抑制SCFβ-TrCPE3泛素连接酶抑制MM细胞的转移和侵袭

引言

材料与方法

结果

讨论

参考文献：

综述：泛素-蛋白酶体途径与多发性骨髓瘤的耐药和侵袭

附录：博士研究生期间发表的文章

致谢