Gas6减轻缺氧无血清诱导下大鼠骨髓间充质干细胞的凋亡

摘要

目的：冠心病是对人类健康造成威胁的最主要疾病之一，冠心病的防治对提升病人生活质量以及减轻国家医药负担具有重要意义。骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）应用于缺血心肌的功能恢复具有良好的安全性及疗效，然而MSCs在移植部位存在时间有限显著影响了MSCs的疗效，如何提升MSCs的存活时间具有重要的研究价值。Gas6在炎症反应、血管新生，细胞存活、增殖、粘附等方面都起着重要的调控作用。前期研究证明，Gas6能激活PI3K/Akt通路，促进EPC的增殖和迁移，但Gas6可否延缓缺氧无血清条件诱导的MSCs的凋亡尚无研究报道。本实验拟观测Gas6干预下对缺氧及无血清诱导下MSCs凋亡率及各凋亡蛋白的表达水平的影响，探索Gas6对缺氧及无血清诱导条件下凋亡的MSCs的保护作用。
　　方法：1.提取SD大鼠骨髓MSCs，培养并鉴定细胞；2.给予MSCs无血清，1%O2条件，在不同缺氧时间（0h,3h,6h,12h,24h,48h）下处理，流式细胞术检测细胞凋亡率；3.摸索出合适缺氧时间后，将实验分为以下6组：无血清1%O2条件下：0ng/mLGas6、50ng/mLGas6、100ng/mLGas6、200ng/mLGas6、400ng/mLGas6以及正常对照组，流式细胞术对各组细胞凋亡情况进行检测；4.将实验分为6组：无血清1%O2条件下：0ng/mLGas6、50ng/mLGas6、100ng/mLGas6、200ng/mLGas6、400ng/mLGas6以及正常对照组，体外Tunel实验对各组细胞凋亡情况进行检测；5.将实验分为2组：无血清1%O2条件下：对照组，200ng/mLGas6干预组， Western-blot方法检测Gas6在1%O2浓度及无血清条件下对抗凋亡蛋白BCL-2、以及凋亡蛋白BAX、caspase-3等凋亡蛋白表达情况的影响。
　　结果：1.提取的大鼠骨髓原代细胞单层贴壁生长，呈长梭形纺锤状，细胞折光率低，细胞表面标志 CD29、CD90阳性表达，CD31、CD45阴性表达，证实培养的细胞为MSCs；2.MSCs于1%O2缺氧条件下6h后细胞凋亡率与未缺氧MSCs相比差异有统计学意义（P＜0.05），为后续实验结果的稳健性，选取12h作为后续实验缺氧时间；3.采用无血清，1%O2浓度，12h缺氧时间条件对MSCs进行处理，以50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mLGas6分别对MSCs进行预处理，流式细胞术结果显示，在以大于100ng/mLGas6浓度刺激细胞时,MSCs凋亡率显著减少，差异具有统计学意义（P＜0.05）；4. Tunel结果显示，当Gas6的刺激浓度大于100ng/mL时，凋亡细胞数目显著减少，与阴性对照组相比差异具有统计学意义（P＜0.05）；5.Western-blot结果显示，在以200ng/mLGas6对MSCs进行刺激时，凋亡蛋白 BAX表达水平降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），抗凋亡蛋白BCL-2，凋亡蛋白Caspase-3表达水平无显著差异性（P＞0.05）。BCL-2/BAX水平明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。
　　结论：在以大于100ng/mL的Gas6浓度处理MSCs时，Gas6预处理的MSCs组凋亡率明显降低，凋亡蛋白BAX表达水平降低，抗凋亡蛋白BCL-2，凋亡蛋白Caspase-3水平无显著差异，BCL-2/BAX水平显著升高，Gas6对缺氧无血清条件下诱导的MSCs凋亡具有保护作用(P<0.05)。

目录

声明

前言

材料和方法

1. 实验材料

1.1 SD大鼠骨髓间充质干细胞

1.2 主要实验仪器

1.3主要试剂及配制方法

2. 试验方法

2.1细胞培养

2.2细胞鉴定

2.3 实验分组

2.4 流式细胞术测凋亡

2.5 Tunel测凋亡

2.6 western blot

结果

1.原代MSCs的鉴定

2.不同缺氧时间对MSCs凋亡率的影响

3.Gas6对无血清及缺氧条件诱导下MSCs凋亡率的影响

3.1 Gas6对无血清及缺氧条件诱导下MSCs凋亡率的影响（流式细胞术）

3.2 Gas6对缺氧及无血清条件诱导MSCs凋亡率的影响（Tunel实验）

4.Gas6对MSCs凋亡蛋白表达的影响

讨论

参考文献

综述:骨髓间充质干细胞：缺血性心脏病的曙光

致谢