平滑肌细胞P2Y12受体在动脉粥样硬化进展中的作用及机制研究

摘要

本文分为以下几个部分:
　　第一部分：P2Y12受体与动脉粥样硬化进展
　　目的：P2Y12受体在体内主要表达于血小板上，ADP与血小板P2Y12受体结合后可诱导血小板聚集。有研究发现，P2Y12受体在人的颈动脉斑块内也有表达，并且主要分布在斑块内平滑肌细胞上，表明平滑肌细胞P2Y12受体可能与动脉粥样硬化进展有一定关系。本部分研究旨在ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠上进一步验证平滑肌细胞P2Y12受体与斑块进展的相关性，并探究平滑肌细胞P2Y12受体表达增高的潜在分子生物学机制。
　　方法：通过高脂饲料喂养ApoE-/-小鼠获得动脉粥样硬化模型。高脂饲养4周或12周后，ApoE-/-小鼠主动脉被分离出来进行油红o染色，或者制成石蜡／冰冻切片行免疫荧光染色及免疫组化染色。动脉粥样硬化程度以主动脉油红o阳性区域面积比主动脉总面积来评估，斑块内成分用免疫荧光染色方法显示。小鼠主动脉平滑肌原代细胞通过组织块贴壁法获得。平滑肌细胞P2Y12受体水平通过免疫印迹以及聚合酶链式反应检测。
　　结果：随着高脂饲养时间的延长，P2Y12受体在斑块内表达逐渐增多，并且主要分布于平滑肌细胞上。定量分析显示，斑块大小和斑块内P2Y12阳性的平滑肌细胞数目具有一定的线性相关性（y=0.0119x+0.095,R2=0.6318,P<0.001）。在体外培养的小鼠主动脉平滑肌细胞上，发现，促动脉粥样硬化因子氧化型低密度脂蛋白（OxLDL）可以通过激活转录因子NF-kB诱导平滑肌细胞表达P2Y12受体。结论：平滑肌细胞P2Y12受体与动脉粥样硬化斑块进展密切相关。
　　第二部分：P2Y12受体通过cAMP/PKA通路调节平滑肌细胞迁移及F-actin解聚
　　目的：平滑肌细胞在动脉粥样硬化进展中发挥着重要作用。其从中膜迁移到内膜后可以增殖、产生细胞外基质、参与泡沫细胞形成从而参与动脉粥样硬化进展。本部分旨在研究平滑肌细胞P2Y12受体能否通过调节其迁移、增殖来参与斑块进展，并探究其中的潜在机制。
　　方法：P2Y12受体激动剂ADP以及阻断剂2-MeSAMP被用来研究P2Y12受体功能。Transwell实验及划痕实验用来评估平滑肌细胞纵向迁移能力及横向迁移能力。免疫荧光标记的鬼笔环肽用来标记平滑肌细胞纤维状肌动蛋白（F-actin）变化。cAMP/PKA活性采用酶联免疫吸附法测定。细胞增殖能力采用Ki67免疫荧光染色方法进行研究。
　　结果：P2Y12受体激动剂ADP（10uM）可以促进平滑肌细胞迁移以及F-actin解聚,P2Y12受体阻断剂2-MeSAMP（100uM）则抑制ADP诱导的平滑肌细胞迁移以及F-actin解聚。ADP可以诱导cofilin脱磷酸化，2-MeSAMP则能抑制ADP诱导的cofilin脱磷酸化。Cofilin经位点突变为持续磷酸状态后，ADP诱导的F-actin解聚以及细胞迁移则被显著抑制。P2Y12受体被ADP激活后可抑制cAMP/PKA信号通路活性，从而诱导cofilin脱磷酸化进而促进平滑肌细胞迁移。平滑肌细胞经P2Y12受体激动剂或P2Y12受体抑制剂处理6小时后，增殖能力无明显改变。但和对照组相比，单独加入激动剂ADPβs处理72小时后，平滑肌细胞增殖能力显著增加。当激动剂和抑制剂同时处理平滑细细胞72小时后，P2Y12受体激动剂则不能增加平滑细细胞增殖能力。
　　结论：P2Y12受体可以调节平滑肌细胞迁移及增殖能力。
　　第三部分：P2Y12受体抑制剂氯吡格雷具有抗动脉粥样硬化作用
　　目的：P2Y12受体拮抗剂氯吡格雷是传统的抗血小板聚集药物。然而有研究表明，P2Y12受体拮抗剂也可以显示出直接抗动脉粥样硬化的作用，同时也有一些研究得出了阴性结论。之前的研究已经证明，P2Y12受体可以调节平滑肌细胞迁移和增殖能力。因此本部分研究旨在高脂喂养的ApoE基因敲除小鼠上进一步探究1）氯吡格雷是否具有抗动脉粥样硬化作用；2）氯吡格雷是否通过抑制平滑肌细胞迁移增殖来影响动脉粥样硬化进展。
　　方法：ApoE-/-小鼠在给予高脂喂养的同时被随机分为两组，一组给予P2Y12受体阻断剂氯吡格雷（20mg/kg/d)，另一组给予等量生理盐水作为对照。高脂饲养4周或12周以后，ApoE-/-小鼠主动脉被分离出来，行油红o染色或免疫荧光或免疫组化染色，据此对动脉粥样硬化程度以及斑块内成分进行分析。主动脉组织cAMP/PKA活性采用酶联免疫吸附法检测。
　　结果：与对照组相比，氯吡格雷给药4周并没有显示出抗动脉粥样硬化作用。但是氯吡格雷给药12周却可以显著减小全主动脉及主动脉弓部粥样硬化斑块大小。此外，氯吡格雷能显著减少斑块内P2Y12阳性的平滑肌数目，并抑制主动脉cAMP/PKA通路活性以及cofilin脱磷酸化。氯吡格雷治疗还能抑制斑块内平滑肌细胞增殖。
　　结论：氯吡格雷可能通过抑制平滑肌细胞迁移增殖来抑制动脉粥样硬化进展。

目录

声明

缩写词语名称英汉对照

前言

参考文献

第一部分P2Y12在动脉粥样硬化斑块内平滑肌细胞上高表达

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

参考文献

第二部分：P2Y12受体调节平滑肌细胞迁移及其机制研究

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

参考文献

第三部分P2Y12受体抑制剂氯吡格雷具有抗动脉粥样硬化作用

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

参考文献

全文总结

附录攻读学位期间发表的论文

致谢