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摘 要
Abstract
目 录
1. 绪论
1.1. 酯酶/脂肪酶的简介
1.2. 酯酶/脂肪酶的用途
1.2.1. 酯酶的主要用途
1.2.2. 脂肪酶的主要用途
1.3. 酯酶/脂肪酶的改造
1.3.1. 酯酶的改造
1.3.2. 脂肪酶的改造
1.4. 理性设计酶的定义及方法
1.5. 酶热稳定性的理性设计
1.5.1. 蛋白质热稳定性的类型
1.5.2. 影响蛋白质热稳定性的因素
1.5.3. 改善蛋白质热稳定性的理性设计
1.6. 新酶的从头设计
1.7. 本研究的目的和意义
2. 理性设计单点突变提高酶热稳定性方法的评测
2.1. 材料与方法
2.1.1. 数据集构建
2.1.2. 运用多种算法预测数据集中点突变的ΔΔG值
2.1.3. 算法评估
2.1.4. 算法组合
2.2. 结果与分析
2.2.1. 算法评测数据集构建
2.2.2. 算法评测
2.2.3. 算法组合
2.3. 讨论与小结
2.3.1. 讨论
2.3.2. 小结
3. 结合多种理性方法设计单点突变提高酶热稳定性研究
3.1. 材料与方法
3.1.1. 菌株和生长条件
3.1.2. 蛋白质X射线晶体结构处理
3.1.3. 点突变预测
3.1.4. 生物信息学分析
3.1.5. RML的基因克隆，表达和纯化
3.1.6. 表观解链温度值测量
3.1.7. 酶学特性分析
3.1.8. 同源建模
3.1.9. 分析蛋白质突变改变热稳定性的基础
3.2. 结果与分析
3.2.1. 通过理性预测算法预测提高热稳定性的突变点
3.2.2. 功能位点分析
3.2.3. 突变体基因的克隆，表达及纯化
3.2.4. 突变体Tapp m值测定
3.2.5. 单点突变的叠加效应
3.2.6. 比较野生型 RML和T18K/T22I/E230I突变体的酶学特性
3.2.7. 构建T18K/T22I/E230I突变体的三维构型
3.2.8. 突变位点的分子间相互作用分析
3.3. 讨论与小结
3.3.1. 讨论
3.3.2. 小结
4. 结合多种理性方法设计二硫键提高酶热稳定性研究
4.1. 材料与方法
4.1.1. 材料
4.1.2. 质粒，菌株和生长条件
4.1.3. 潜在二硫键的合理预测
4.1.4. 功能位点分析
4.1.5. 设计二硫键的稳定性效应预测和视觉检测
4.1.6. 基因克隆，表达和蛋白质纯化
4.1.7. 是否形成二硫键的测定
4.1.8. 测量表观熔解温度（Tapp m）
4.1.9. 酶学特性测定
4.2. 结果与分析
4.2.1. 潜在二硫键的合理预测
4.2.2. 功能位点筛选
4.2.3. 设计的二硫键的稳定性评估和视觉检查
4.2.4. 二硫键的表达，纯化和测定
4.2.5. 引入的二硫键对热稳定性的影响
4.2.6. 二硫键组合突变体的表达
4.2.7. 组合突变体的酶学性质
4.2.8. RML突变体与野生型RML的酶学性质比较
4.3. 讨论与小结
4.3.1. 讨论
4.3.2. 小结
5. 水解对硝基苯基乙酸酯新酶的从头设计探索
5.1. 材料与方法
5.1.1. 试剂和材料
5.1.2. 理论酶构建
5.1.3. 构建蛋白骨架库
5.1.4. 理论酶与蛋白骨架库进行匹配
5.1.5. 优化设计酶构象
5.1.6. 设计酶的评估筛选和排序
5.1.7. 设计酶的全基因合成，克隆表达，分离纯化
5.1.8. 设计酶的催化活性测定
5.1.9. 设计酶的催化性质的验证
5.2. 结果与分析
5.2.1. 通过量子化学计算构建理论酶
5.2.2. 构建蛋白质骨架结构库
5.2.3. 理论酶构象与支架蛋白进行匹配
5.2.4. 匹配结果的重新设计
5.2.5. 设计酶的评估和排序
5.2.6. 设计酶的全基因合成，克隆表达，分离纯化
5.2.7. 设计酶的酶活测定
5.2.8. 设计酶的酶活来源鉴定
5.3. 讨论与小结
5.3.1. 讨论
5.3.2. 小结
6. 全文总结
致 谢
参考文献
附录1 攻读博士学位期间发表论文目录
附录2 主要设备与仪器
附录3 主要缩写词
附录4 文中所述的主要程序文件
附录5 文中所构建的骨架蛋白库
