声明
中英文缩略词对照表
前言
1 实验材料与试剂
1.1 实验主要仪器与设备
1.2 实验材料
1.3 主要实验试剂
1.4 主要溶液配制
1.4.1 1×PBS缓冲液
1.4.2 PEI转染试剂
1.4.3 RIPA裂解液
1.4.4 DMEM细胞完全培养基(500ml)
1.4.5 细胞冻存液(10ml)
1.4.6 LB液态培养基(1L)
1.4.7 LB固态培养基(1L)
1.4.8 SOB培养基
1.4.9 10×Running Buffer
1.4.10 Trans Buffer(转膜液)
1.4.11 2×SDS蛋白上样缓冲液
1.4.12 ECL化学发光液
1.4.13 10×TBE缓冲液(1L)
1.4.14 1%琼脂糖凝胶溶液(20ml)
1.4.15 SDS-PAGE凝胶溶液配制相关的试剂
1.4.16 TBST缓冲液
1.4.17 感受态制备相关溶液
1.4.18 甲基纤维素溶液
1.4.19 1%结晶紫溶液
2 实验方法
2.1贴壁细胞的复苏、传代与冻存
2.2 病毒的培养和滴度测定
(2) 病毒滴度测定
2.3 SH-SY5Y细胞上清中寨卡病毒滴度测定
2.4真核表达载体构建实验
(1) PCR扩增目的基因
(2) 双酶切法线性化克隆载体
(3)连接目的基因和载体(详见诺唯赞ClonExpress IIOne Step Cloning Kit)
(4) 反应产物转化
(5) 涂板
(6) 克隆鉴定(菌落PCR法)
(7) 测序
(8) 质粒提取(参照天根生化科技有限公司的无内毒素大提试剂盒说明书)
2.5 点突变体构建
(3) DpnI消化模板质粒DNA
(4)取5μl反应液转化、涂板、挑菌、测序
2.6 细胞转染
2.7 RT-PCR实验
(1) RNA提取(Trizol裂解法)
(2) 逆转录PCR反应 (详见诺唯赞R223-01说明书)
(3) qPCR反应
2.8Western Blot实验
(1)总蛋白提取(冰上操作)
(2) 细胞中胞浆、胞核蛋白的提取(详见康维世纪Nc-细胞核/浆蛋白抽提试剂盒)
(3) SDS-PAGE电泳
(8)蛋白质条带检测
2.9 免疫共沉淀实验
(1)总蛋白提取
(2)免疫沉淀
(3)样本分析
2.10 泛素化实验
2.11 免疫共聚焦实验
2.12 双荧光素酶报告实验
2.13 DH5α感受态制备
2.14 数据统计与结果分析
3 实验结果
3.1 SZ-WIV01寨卡病毒株显著抑制I型干扰素的产生
3.2 SZ-WIV01寨卡病毒株通过其非结构蛋白NS3和NS2B3来拮抗I型干扰素的产生
3.2.1 SZ-WIV01病毒蛋白质粒的真核表达验证
3.2.2 NS3和NS2B3可显著抑制poly(I:C)诱导的IFNβ及ISGs表达
3.2.3 NS3和NS2B3干扰poly(I:C)诱导的IRF3蛋白核易位
3.3. NS3和NS2B3分别通过靶向并结合MAVS和MITA蛋白来负向调控IFNβ表达
3.3.1 NS3干扰MAVS或其上游蛋白诱导的IFNβ表达，而NS2B3则作用于MITA或其上游
3.3.2 NS3和NS2B3分别与MAVS和MITA发生蛋白相互结合
3.4. NS3-MAVS，NS2B3-MITA相互作用区域研究
3.4.1 MAVS/MITA与NS3/NS2B3截短体相互作用区域研究
3.4.2 NS3/NS2B3与MAVS/MITA截短体相互作用区域研究
3.5. NS3和NS2B3分别特异性的下调MAVS和MITA蛋白的表达
3.5.1 SZ-WIV01病毒抑制细胞中MAVS和MITA的蛋白表达
3.5.2 NS3和NS2B3分别抑制MAVS和MITA蛋白的表达
3.5.3 NS3和NS2B3分别在蛋白水平而非mRNA水平干扰MAVS和MITA的表达
3.5.4 NS3及NA2B3蛋白存在下MAVS和MITA降解速率探究
3.5.5 NS3对MAVS及NS2B3对MITA的蛋白表达调控依赖于蛋白间的相互结合
3.5.6 NS3及NS2B3对MAVS和MITA各个截短体蛋白表达的影响
3.6. NS3和NS2B3主要依赖蛋白酶体系统来降解MAVS和MITA
3.7. NS3、NS2B3对MAVS或MITA蛋白泛素化翻译后修饰的影响
3.7.1 NS3和NS2B3分别通过催化MAVS和MITA的K48泛素化修饰来促进其降解
3.7.2 NS2B3通过抑制MITA的K63泛素化修饰来抑制RLRs通路的信号传导
3.7.3 NS3和NS2B3对MAVS和MITA蛋白其他泛素化修饰类型的影响
讨论
参考文献
附表
综述:寨卡病毒研究进展
参考文献
研究生期间文章发表情况
致谢
