绝经后甲状腺结节的雌激素水平与雌激素代谢相关基因的表达

摘要

目的:甲状腺结节是最常见的甲状腺增生性疾病。流行病学调查显示，甲状腺结节的患病率女性比男性高4-5倍。体外细胞实验也证明，雌激素可通过其受体α(ERα)或受体β(ERβ)促进细胞的增殖。因此，体内的雌激素在甲状腺结节的形成中可能发挥一定的作用。
　　然而，绝经后女性与相同年龄阶段的男性甲状腺结节的发病率相似，且都随年龄的增加而增加。此阶段形成的结节与血清或甲状腺结节局部的雌激素水平是否相关未见报道。
　　雌激素是一组低分子天然固醇类激素，在人体内有三种形式:雌酮(E1)、雌二醇(E2)、雌三醇(E3)。其中，E2是活性最强的雌激素，是绝经前妇女体内主要的雌激素种类;2-甲基氧雌二醇(2ME2)与E1、E2、E3相比，对雌激素受体的亲和力最低，并且有抑制增殖、促进凋亡的作用。甲状腺中的雌激素既可来自血液也可原位合成。甲状腺结节雌激素水平除了与摄取、合成相关外，还决定于雌激素在细胞内的代谢转化。17β羟固醇脱氢酶(HSD17B)是一类参与雌激素代谢的酶，其中， HSD17B1和HSD17B7催化E1向高活性的E2转化;而HSD17B2、HSD17B4、HSD17B8和HSD17B14则催化E2向低活性E1的转化。
　　为确定绝经后女性全身和结节局部雌激素是否与甲状腺结节形成有关，本实验以绝经后甲状腺结节患者为研究对象，通过测定其血清、结节组织和结节旁组织中的E1、E2、2ME2水平，雌激素受体:ERα、ERβ、GPR30基因的表达水平，以及雌激素代谢相关酶:HSD17B1、HSD17B2、HSD17B4、HSD17B7、HSD17B8、HSD17B14基因的表达，探讨它们在甲状腺增生性疾病中的作用，为预防和治疗该类疾病提供实验依据。
　　方法:
　　1取材和分组
　　甲状腺标本取材自河北医科大学第二医院腺体外科2013年2月至9月手术切除的甲状腺肿物。结节和结节旁组织(1)分别置于冻存管中，冻于-80℃冰箱，用于RNA的提取和E1、E2、2ME2的测定。(2)送病理科作病理诊断。根据病理结果，甲状腺结节组织为结节组;结节旁正常甲状腺组织为对照组。采集甲状腺肿物切除术前的患者空腹血清，用于甲状腺功能以及E1、E2、2ME2的测定。
　　2甲状腺功能的测定
　　采用放射免疫分析法(RIA)测定血清FT3、FT4浓度，用免疫放射法(IRMA)测定血清TSH浓度。
　　3甲状腺组织和血清E1、E2和2ME2含量的测定
　　3.1甲状腺组织匀浆的制备
　　甲状腺组织用生理盐水制备成1％的组织匀浆，用于蛋白质、组织E1、E2和2ME2的测定。
　　3.2甲状腺组织中蛋白定量
　　以牛血清白蛋白为标准，用考马斯-亮兰法测定蛋白浓度，结果以mg/ml表示。
　　3.3甲状腺组织和血清E1含量的测定
　　采用酶联免疫吸附剂测定法进行测定。组织中的E1含量以每毫克样本蛋白含有的E1表示(pg/mg pr);血清中E2含量以每毫升血清含有的E2表示(pg/ml)。
　　3.4甲状腺组织和血清E2含量的测定
　　采用液相平衡竞争放射免疫分析法测定。组织中的E2含量以每毫克样本蛋白含有的E2表示(pg/mg pr);血清中E2含量以每毫升血清含有的E2表示(pg/ml)。
　　3.5甲状腺组织和血清2ME2含量的测定
　　采用酶免疫法测定。组织中的2ME2含量以每毫克样本蛋白含有的2ME2表示(pg/mg pr)。血清中2ME2含量以每毫升血清含有的2ME2表示(pg/ml)。
　　4 Real-time PCR
　　应用E.Z.N.A.TM Total RNA KitⅡR6934-01试剂盒(OMEGA bio-tek)提取RNA。应用invitrogen公司的M-MLV First Strand Kit反转录试剂盒(catno.C28025-032)对提取的RNA进行反转录，合成cDNA。使用Bestar(R)SybrGreen qPCR mastermix(DBI Bioscience)试剂盒，对目的基因进行扩增。基因的相对表达量用2(-ΔCt)表示。
　　5数据分析
　　实验数据采用SPSS22.0软件进行统计学分析。数据经检验，不符合正态分布，故计量资料采用中位数（最小值，最大值）表示，组间差异采用秩和检验分析，P＜0.05为差异有统计学意义。相关性使用Spearman秩相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果:
　　1一般资料
　　32例绝经后女性甲状腺结节患者中，46～50岁6例，51～63岁26例。病理类型为单纯结节性甲状腺肿17例，结节性甲状腺肿伴腺瘤样增生10例，结节性甲状腺肿伴钙化、纤维化、囊性变5例。甲状腺功能正常的患者31例，甲状腺功能亢进1例。
　　2绝经后甲状腺结节患者血清E2水平高于正常人
　　经单样本秩和检验，患者血清E2为58.87(40.21，114.62) pg/ml，高于绝经后的正常人血清E2的最高值31pg/ml，P＜0.01。结果表明，绝经后患甲状腺结节的女性血清E2水平增高。
　　3甲状腺组织中E1、E2、2ME2的含量
　　3.1结节组甲状腺的E2含量高于对照组
　　结节组E2的含量为3.17(1.30，10.21)pg/mg，高于对照组2.16(0.51，7.30) pg/mg，差异有统计学意义(Z=2.052，P＜0.05)，但与血清中的E2含量无相关性（结节组r=0.252，P=0.430;对照组r=0.282，P=0.401）。说明结节组织中E2的水平的升高与血液E2的升高无关，结节的形成可能与局部E2的高水平有关。
　　3.2结节组甲状腺的E1水平与对照组无差别
　　结节组E1的含量为25.05(11.76，104.56) pg/mg，对照组为18.62(6.37，86.89) pg/mg，差异无统计学意义（Z=1.127，P=0.260）。组织中E1的含量与血清中的E1含量无相关性（结节组r=0.865，P=0.067;对照组r=0.637，P=0.183）。说明甲状腺组织中E1的含量与血液中E1的含量无关，结节组甲状腺的E1含量与对照组无差别。
　　3.3结节组甲状腺的2ME2水平与对照组无差别
　　结节组2ME2的含量为3.52(1.42，13.82) pg/mg，对照组为2.87(0.78，9.11)pg/mg，差异无统计学意义（Z=1.851，P=0.064）。组织中的2ME2含量与血清中的2ME2含量无相关性（结节组r=0.533，P=0.139;对照组r=0.450，P=0.224）。说明甲状腺组织中的2ME2含量与血液中的含量无关，结节组甲状腺的2ME2含量与对照组无差别。
　　4与雌激素代谢相关的基因mRNA表达
　　5.1结节组和对照组均表达与E2合成相关的基因
　　结节组HSD17B1 mRNA的表达水平为0.1566(0.01，7.10)，高于对照组0.09(0.01，4.52)，差异有统计学意义(Z=2.068，P＜0.05)。
　　HSD17B7 mRNA结节组的表达水平为9.11(1.08，60.63)，对照组为6.22(1.96，57.59)，差异无统计学意义(Z=1.125，P＞0.05)。
　　上述结果表明，结节组E2水平的升高可能与HSD17B7 mRNA的表达无关，而与HSD17B1 mRNA表达升高有关。
　　5.2结节组和对照组均表达与E2失活相关的基因
　　HSD17B2 mRNA结节组表达水平为0.03(0.0004，1.09)，对照组为0.01(0.0003，1.64)，差异无统计学意义(Z=1.703，P＞0.05)。
　　HSD17B4 mRNA结节组表达水平为7.68(1.74，62.34)，对照组为6.84(0.81，19.44)，差异无统计学意义（Z=1.399，P＞0.05）。
　　HSD17B8 mRNA病变组表达水平为57.29(5.29，149.82)，对照组为47.84(5.19，151.56)，差异无统计学意义(Z=0.274，P＞0.05)。
　　HSD17B14 mRNA病变组表达水平为11.05(2.38，90.56)，对照组为12.52(0.72，140.63)，差异无统计学意义（Z=0.213，P＞0.05）。
　　上述结果表明，结节组E2水平的升高不是由于以上E2失活基因表达的降低造成的。
　　5.3结节组和对照组均表达雌激素受体基因
　　ERαmRNA结节组的表达水平为0.43(0.0057，49.8936)，高于对照组0.07(0.01，7.34)，差异有统计学意义（Z=2.062，P＜0.05）。
　　ERβmRNA结节组表达水平为0.03(0.001，0.61)，对照组为0.02(0.003，0.27)，差异无统计学意义(Z=1.616，P＞0.05)。
　　GPR30 mRNA结节组表达水平为12.01(1.71，150.59)，对照组为13.70(0.47，33.61)，差异无统计学意义（Z=0.152，P＞0.05）。
　　上述结果表明，结节组E2通过ERα途径介导的作用增强。
　　结论:
　　1绝经后甲状腺结节患者血清E2水平高于正常参考值。
　　2绝经后甲状腺结节患者结节组织中高水平的E2可能与HSD17B1的高表达有关。
　　3结节组织中高水平的E2可能经高表达的ERα受体介导，在绝经后甲状腺结节的形成中发挥作用。

目录

声明

摘要

英文缩写

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 雌激素及抗雌激素药物与甲状腺增生性疾病

致谢

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