东北茶藨子叶中主要黄酮类成分的提取、富集及其生物活性研究

摘要

本论文针对东北茶藨子叶中七种主要的黄酮类成分芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、三叶豆苷、紫云英苷、槲皮素和山柰酚开发了一种绿色高效的微波辅助低共熔溶剂提取技术，并对其工艺参数进行了系统性的优化，同时结合大孔吸附树脂对提取液中的黄酮进行了富集纯化，并对纯化物进行了系统性的抗氧化活性和抗炎活性评价。本论文的主要研究及结果如下:
　　1.建立了高效液相色谱同时检测东北茶藨子叶中芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、三叶豆苷、紫云英苷、槲皮素和山柰酚的色谱条件:
　　色谱柱:Diamonsil5μm C18(2)column，(250mm×4.6mm i.d.);流动相:0.5％磷酸水溶液(A)-乙腈(B);流速:0.8mL/min;柱温:40℃;检测波长:360nm;进样量:20μL。梯度洗脱条件:0-7min，10-15％(B);7-10min，15-17％(B);10-25min,17-17％(B);25-27min,17-18％(B);27-31min,18-19％(B);31-34min,19-19％(B);34-38min,19-26％(B);38-42min,26-26％(B);42-55min,26-50％(B);55-60min,50-10％(B)。
　　2.对微波辅助低共熔溶剂提取东北茶藨子叶中七种主要黄酮类成分的各项参数进行优化，考察了DES种类、氢供体与氢受体配比、含水量、提取的液固比、提取温度及提取时间对芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、三叶豆苷、紫云英苷、槲皮素和山柰酚提取率的影响，并确定了最优提取参数:
　　低共熔溶剂:氯化胆碱∶乳酸=1∶2（摩尔比，含水量为25％）
　　提取温度:54℃
　　提取时间:10min
　　液固比:27∶1mL/g
　　在以上最优提取参数的提取工艺下提取东北茶藨子叶，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、三叶豆苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚提取率的平均值分别为1.26mg/g、0.33mg/g、2.59mg/g、4.81mg/g、1.16mg/g、0.35mg/g、0.10mg/g，提取效果优于热回流辅助低共熔溶剂提取法和超声辅助低共熔溶剂提取法。
　　3.利用大孔吸附树脂成功的对东北茶藨子叶低共熔溶剂提取液中七种主要黄酮成分进行了富集纯化，建立并优化了富集纯化条件，结论如下:
　　利用D101、NKA-9、AB-8、HPD-400、HP20、HPD-826、X-5和LSA-10八种型号大孔吸附树脂对提取液中黄酮类成分进行富集纯化，其中X-5型大孔吸附树脂为富集纯化东北茶藨子叶提取物的最优树脂，使用X-5型大孔吸附树脂富集纯化后，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、三叶豆苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚的回收率分别为79.64％、88.08％、81.37％、87.02％、87.13％、97.36％、99.39％。
　　4.检测了东北茶藨子叶提取物的体外抗氧化活性和抗炎活性:
　　首先使用DPPH法、ABTS法和FRAP法检测了HPD-826、AB-8和X-5三种类型大孔吸附树脂富集纯化的东北茶藨子叶片提取物的抗氧化活性，三种方法检测均为X-5型大孔吸附树脂富集纯化的东北茶藨子叶溶液的提取物的抗氧化能力最强。然后通过LPS诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞，使得对数期的RAW264.7细胞产生炎症反应，通过炎症反应激发细胞分泌炎症因子，通过MTT、NO释放量和IL-10因子的表达情况，验证东北茶藨子叶提取物具有抗炎活性。
　　综上所述，本研究对微波辅助低共熔溶剂提取东北茶藨子叶中七种黄酮类成分的提取工艺进行了优化，并使用大孔吸附树脂富集、纯化提取液，并对大孔吸附树脂富集纯化后的提取物的抗氧化能力和抗炎能力进行了评价，为全面开发及高效利用东北茶藨子这一植物资源提供了理论基础和科学依据。

目录

摘要

1 绪论

1．1．3 茶麃子属植物的研究概述

1．2 黄酮类化合物的概况及其生物活性

1．2．1 黄酮类化合物及其分类简介

1．2．2 黄酮类化合物的抗氧化活性

1．2．3 黄酮类化合物的抗炎活性

1．2．4 黄酮类化合物的其他活性

1．3 低共熔溶剂概述

1．4 微波辅助提取技术概述

1．5 大孔吸附树脂富集纯化技术简介

1．6 常用的体外生物活性检测方法

1．6．1 抗氧化活性检测方法

1．6．2 抗炎活性检测方法

1．7 本课题研究的目的和意义

2 东北茶麃子叶中七种主要黄酮成分分析方法的建立

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 实验仪器与试剂

2．2．2 标准溶液的配制

2．3．1 色谱条件的优化

2．3．2 东北茶麃子叶样品溶液的测定

2．3．3 方法学验证

2．4 本章小结

3 东北茶麃子叶中七种主要黄酮成分的提取工艺研究

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 实验仪器与试剂

3．2．2 微波辅助提取装置

3．2．3 东北茶麃子叶中主要黄酮成分的HPLC分析

3．2．4 提取率的计算

3．2．5 低共熔溶剂的筛选与优化

3．2．6 微波辅助低共熔溶剂提取工艺参数的BBD优化实验

3．2．7 不同提取溶剂和工艺的比较

3．3 结果与讨论

3．3．1 低共熔溶剂种类的筛选

3．3．2 低共熔溶剂配比的筛选

3．3．3 低共熔溶剂含水量的优化

3．3．4 微波辅助低共熔溶剂提取工艺参数优化结果

3．3．5 不同提取溶剂和工艺的比较

3．4 本章小结

4 东北茶麃子叶中七种主要黄酮成分的富集纯化工艺研究

4．1 前言

4．2 实验部分

4．2．1 实验仪器与试剂

4．2．2 大孔吸附树脂物理参数

4．2．3 大孔吸附树脂预处理

4．2．4 大孔吸附树脂含水率的测定

4．2．7 东北茶麃子叶提取液中七种主要黄酮成分的富集纯化

4．2．8 大孔吸附树脂的再生

4．3 结果与讨论

4．3．1 大孔吸附树脂对东北茶麃子中七种主要黄酮成分的吸附和解吸

4．3．2 七种主要黄酮成分的富集纯化结果

4．4 本章小结

5 东北茶麃子叶主要黄酮化合物体外生物活性探究

5．1 前言

5．2 实验部分

5．2．1 实验仪器与试剂

5．2．2 东北茶麃子叶主要黄酮成分的HPLC分析

5．2．4 东北茶麃子叶提取物抗炎活性测定

5．3 结果与讨论

5．3．2 东北茶麃子叶提取物的抗炎活性

5．4 本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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