髓系肿瘤中DNMT3A基因突变、表达及酶活性的研究

摘要

目的：髓系肿瘤是指来源于髓系造血系统的一类恶性克隆性疾病，主要包括急性髓系白血病（acute myeloidleukemia，AML）、骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndromes，MDS）和慢性骨髓增殖性肿瘤（chronic myeloproliferative neoplasms，cMPN）等。随着人类基因组计划的完成，基因表达调控即表观遗传学的改变日益引起人们的关注，有研究表明，部分髓系肿瘤患者存在表观遗传学异常，并且是导致疾病发生、发展的重要原因之一。因此，人们通过设计表观调控药物来逆转基因的表观遗传学异常，从而达到治疗疾病的目的。如应用去甲基化药物来抑制DNA甲基转移酶（DNMTs）的活性，使一些由于启动子区域高甲基化而转录沉默的基因恢复低甲基化状态，从而使基因重新表达，基于这种情况，通过降低抑癌基因的甲基化水平，恢复抑癌基因的转录活性，进而最终达到治疗恶性肿瘤的目的。DNA甲基化异常是一种最常见的表观遗传学异常，DNA甲基转移酶3A（DNMT3A）作为其中一个重要的表观遗传学标志物，其在髓系肿瘤的发生、发展和预后判断方面起着非常重要的作用。本研究通过基因测序的方法，对初治髓系肿瘤患者进行DNMT3A基因突变的检测，了解DNMT3A基因突变在髓系肿瘤患者中的发生率及分布情况，同时对比观察DNMT3A基因突变阳性、DNMT3A基因突变阴性的髓系肿瘤患者和正常对照组之间DNMT3A基因的mRNA表达水平及DNMTs蛋白酶的活性，以期明确DNMT3A基因突变对于基因表达以及酶活性的影响，并进一步探索DNMT3A基因突变、mRNA表达水平和DNA甲基转移酶蛋白活性间彼此的内在联系。此外，通过对DNMT3A基因突变与髓系肿瘤患者临床特征、预后进行相关性分析，探讨DNMT3A基因突变率和突变类型的检测成为指导髓系肿瘤预后分子标记物的可行性，并为将来利用DNMT3A作为治疗靶点提供理论基础。
　　方法：
　　1.分离骨髓液标本中单个核细胞，应用DNA提取试剂盒提取细胞基因组DNA。利用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）方法扩增DNA中DNMT3A基因第23号外显子含R882位点的部分片段，然后应用基因测序仪HITACHI3500xL DXGenetic Analyzer对该片段进行测序。
　　2.分离骨髓液标本中单个核细胞，Trizol法提取细胞总RNA，然后应用实时荧光定量聚合酶链反应(real time-PCR，RQ-PCR）方法对DNMT3A基因的mRNA水平进行检测，来反应细胞中DNMT3A基因的表达水平。
　　3.应用同位素示踪法测定骨髓标本细胞中的DNMTs活性，并设白血病细胞株HL-60为阳性对照，同时设阴性对照组（不加甲基受体Poly[d（I-C）d（I-C）]）。以标本同位素液闪计数值除以HL-60同位素液闪计数值，表示DNMTs相对酶活性的大小。
　　结果：
　　1.髓系肿瘤患者中DNMT3A基因突变分析
　　1.1 在所检测的40例初治AML患者中，DNMT3A基因突变的总体发生率为（6/40）15％，在6例DNMT3A基因突变阳性的AML患者中，1例为AML-M2，突变率为（1/15）6.7%；2例为AML-M4，突变率为（2/13）15.4%；3例为AML-M5，突变率（3/12）25%（按WHO分型）。在6例DNMT3A基因突变阳性的AML患者中，4例（66.7%）突变为R882H杂合突变；1例（16.7%）突变为 R882C杂合突变；1例（16.7%）突变为R882P杂合突变。
　　1.2 在所检测的15例MDS患者中，DNMT3A基因突变的发生率为（0/15）0%。
　　1.3 在所检测的15例cMPN患者中，DNMT3A基因突变的发生率为（0/15）0%。
　　2. AML患者DNMT3A基因表达水平分析
　　2.1 DNMT3A基因突变阳性的AML患者DNMT3A mRNA的表达水平为0.9441±0.1309。
　　2.2 DNMT3A基因突变阴性的AML患者DNMT3A mRNA的表达水平为1.0014±0.1146。
　　2.3 对照组DNMT3A mRNA的表达水平为0.9822±0.1021。
　　2.4 DNMT3A基因突变阳性的AML患者与突变阴性的AML患者相比，DNMT3A mRNA表达水平无显著差异（P＞0.05）；DNMT3A基因突变阳性的AML患者与对照组相比，DNMT3A mRNA表达也无显著差异（P＞0.05）；DNMT3A基因突变阴性的AML患者与对照组相比DNMT3A mRNA表达水平亦无明显差别（P＞0.05）。
　　3. AML患者DNMTs相对酶活性比较
　　3.1 6例 DNMT3A基因突变阳性AML患者，DNMTs的相对酶活性为（20.3±2.3）%。
　　3.2 34例DNMT3A基因突变阴性AML患者，DNMTs的相对酶活性为（4.3±2.0）%。
　　3.3 17例对照组中，DNMTs的相对酶活性为（3.9±1.6）%。
　　3.4 DNMT3A基因突变阳性的AML患者与DNMT3A基因突变阴性的AML患者以及对照组相比，DNMTs的相对酶活性均明显升高（均 P＜0.01）；DNMT3A基因突变阴性的AML患者与正常对照组相比，DNMTs的相对酶活性则无明显差异（P＞0.05）。
　　4.DNMT3A基因突变阳性的 AML患者与DNMT3A基因突变阴性的AML患者的临床特征及预后分析
　　DNMT3A基因突变阳性的6例AML患者中，4例为男性，2例为女性；患者的年龄M=32.5岁；白细胞数（×109/L）16.09±5.65；骨髓原始细胞数（53±13.14）%；血小板数（×109/L）M=69；血红蛋白（g/L）74±16.91。经过一个疗程的标准化疗诱导治疗后完全缓解（CR）率为（4/6）66.7%。DNMT3A基因突变阴性的34例AML患者中，20例为男性，14例为女性；患者的年龄M=46.5岁；白细胞数（×109/L）M=12.13；骨髓原始细胞数（57.9±13.46）%；血小板数（×109/L）M=56.5；血红蛋白（g/L）69±25.42。经过一个疗程的标准化疗诱导治疗后完全缓解（CR）率为（28/34）82.4%。两组AML患者临床特征及CR率均无统计学差异。40例AML患者同时检测了FLT3-ITD、NPM1基因突变，在DNMT3A基因突变阳性的6例AML患者中有1例为FLT3-ITD（+）、NPM1（-）；有1例为FLT3-ITD（+）、NPM1（+）；有4例为FLT3-ITD（-）、NPM1（+），其中伴有FLT3-ITD（+）、NPM1（-）；FLT3-ITD（+）、NPM1（+）的2例AML为经一个疗程标准化疗诱导治疗后未达CR的患者。
　　结论：
　　1.在髓系肿瘤中，DNMT3A基因突变的发生率以 AML为最高。共检测到3种DNMT3A基因突变类型，其中R882H突变发生率最高。
　　2.在初治AML患者中，DNMT3A基因突变率与患者性别、年龄、骨髓原始细胞比例、初始白细胞计数等临床特征均无明显相关性。
　　3.在初治AML患者中，DNMT3A基因突变与否并不改变其mRNA的表达水平。
　　4.AML患者发生DNMT3A基因突变后DNMTs酶活性升高。
　　5.DNMT3A基因突变阳性的AML患者经一次标准化疗后CR率与突变阴性的患者无差异。
　　6.在AML患者中DNMT3A基因突变常常伴随NPM1基因突变，AML的预后是由多基因控制的。

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前言

材料与方法

1 材料

2 方法

3 统计学分析

结果

1 6例DNMT3A基因突变阳性的AML患者DNMT3A基因目的片段PCR扩增后的电泳效果图。

2 髓系肿瘤患者中DNMT3A基因突变分析

3 AML患者DNMT3A基因RQ-PCR扩增效果图及DNMT3A基因表达水平分析

4 AML患者DNMTs相对酶活性比较

5 DNMT3A基因突变阳性的AML患者与DNMT3A基因突变阴性的AML患者的临床特征及预后分析

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述: 髓系肿瘤中DNMT3A基因突变、表达及酶活性的研究

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