Mdx小鼠骨骼肌纤维化及Spp1基因表达

摘要

目的:Duchenne型肌营养不良(Duchenne muscular dystrophin，DMD)是以进行性、对称性近端肌肉无力及肌肉萎缩为主要临床特征，以肌肉纤维变性、坏死及纤维化为主要病理特征的X连锁隐性遗传性疾病。患者通常3-5岁隐袭起病，常于12岁出现不能行走，于20-30岁死于呼吸道感染和心力衰竭。
　　尽管dystrophin蛋白缺失作为DMD的发病原因已十分明确，但导致肌肉变性、纤维化的具体机制尚不清楚。纤维化是一种细胞外基质(extracellular matrix，ECM)逐渐沉积、实质细胞逐渐减少的病理改变，可发生于多种不同的器官组织，纤维化的持续进展可致器官结构破坏、功能减退甚至衰竭。DMD患者肌纤维膜dystrophin蛋白缺失，细胞膜结构发生改变，完整性遭到破坏，当受到机械性刺激时，大量钠离子和钙离子内流。细胞内钠离子浓度升高，造成细胞水肿;而钙离子进入细胞内后，作为第二信使激活炎症进程的级联放大反应。同时，炎症细胞释放促纤维化因子，促进成纤维细胞增殖、分化为成肌纤维细胞(myofibroblast，MFb)。成纤维细胞和MFb分泌ECM及ECM重塑因子，导致ECM合成和降解失衡，出现纤维化。
　　分泌型焦磷酸蛋白1(Secreted phosphoprotein1，Spp1)是一种具有多种功能的分泌型酸性糖蛋白，又称骨桥素蛋白(osteopontin，OPN)。OPN作为一种重要的多功能糖蛋白，存在于细胞外基质中，由多种组织及细胞合成和分泌，可与纤连蛋白和胶原等基质分子结合影响细胞外基质重塑，在梗阻性肾病、心肌梗死、创伤修复等纤维化过程中均发挥了重要作用，但目前关于DMD中Spp1与肌纤维化关系的研究较少。
　　Mdx小鼠因与人类具有相同的基因遗传学基础，被广泛应用于DMD的相关研究中。我们的实验主要关注于mdx小鼠骨骼肌中纤维化情况，研究纤维化相关基因在mdx小鼠不同时期的差异表达情况，以及Spp1基因在mdx小鼠及对照鼠中不同时期的表达量变化，进一步探讨在mdx小鼠中Spp1与肌纤维化的关系。
　　方法:选取雄性C57BL/10ScSn-Dmdmdx/JNju鼠为实验组，选取雄性C57BL/6ScSn小鼠为对照组，根据年龄分为2周组、4周组、8周组、12周组。每组选取6只，分别用于常规组织化学染色、基因芯片检测及qRT-PCR。以10％水合氯醛(350mg/Kg体重)腹腔注射麻醉，取小鼠股四头肌，分别进行包埋冰冻处理或直接冰冻处理。通过冰冻切片的常规染色（HE染色）及马松(masson)染色观察骨骼肌纤维化情况;使用基因芯片技术对mdx小鼠不同时期股四头肌进行基因表达谱分析，使用qRT-PCR技术检测不同时期mdx小鼠及对照鼠股四头肌Spp1基因表达情况，并应用spss13.0对数据进行分析。
　　结果:
　　1、不同时期mdx小鼠肌肉纤维化情况
　　H&E染色及马松染色显示mdx小鼠股四头肌纤维化情况:2周时肌纤维排列紧密，个别肌纤维出现变性，未见明显的肌再生，无结缔组织增生;4周时，出现肌肉变性坏死与再生，但肌纤维排列仍较紧密，无明显结缔组织增生;8周时，可见轻微的肌纤维排列疏松，部分小片状区域可见轻度结缔组织增生;12周时，结缔组织增生程度较8周稍加重，但仍为小片状区域的纤维化。(Fig.1、2)
　　2、Mdx小鼠股四头肌基因芯片中与纤维化相关基因的表达情况
　　选取mdx小鼠2周与12周股四头肌基因表达谱进行对比，取P≤0.05，fold-change值≥+2或≤-2为筛选条件，共筛选出差异表达基因2928个，通过Pathway通路分析筛选出与纤维化相关的基因，部分列于Table1。其中Spp1基因2周与12周相比fold-change值为-15.1354，变化明显。
　　3、Spp1基因在mdx小鼠及对照鼠骨骼肌不同时期的表达
　　3.1 Spp1在mdx小鼠股四头肌不同时期表达量比较:8周组较4周组明显升高，12周组较8周组表达量下降，但仍高于4周组，差异均具有统计学意义。
　　3.2 Spp1在mdx小鼠股四头肌与对照鼠表达量比较:8周组与12周组Spp1表达量较同期对照组明显升高，具有统计学差异。
　　3.3 Spp1在对照组股四头肌不同时期表达量比较:各组间均不具有统计学差异。（Fig.3）
　　结论:
　　1、Mdx小鼠早期（2周-4周）肌纤维化表现不明显，8周时骨骼肌内可见少量结缔组织增生，随后缓慢进展。
　　2、Spp1基因在mdx小鼠成熟期（8周-12周）表达量明显增加，推测其在mdx小鼠肌纤维化中发挥一定作用。

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结论

参考文献

综述 DMD中纤维化研究进展

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