IGF-1对人牙髓细胞增殖分化影响的体外及裸鼠体内研究

摘要

目的：探究在胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1,IGF-1）的作用下，人牙髓细胞体外及裸鼠体内的增殖、分化情况。
　　方法：本实验选取因阻生或者正畸减数拔除的健康恒牙（经患者知情同意），采用组织块酶消化法分离、提取人牙髓细胞并进行原代培养，当细胞增殖达到培养瓶底的80％时，用0.25%胰蛋白酶消化并且传代，选取第四代人牙髓细胞作为种子细胞进行以下实验：
　　1.IGF-1对人牙髓细胞体外增殖的影响以2×104个/孔人牙髓细胞接种于96孔培养板中，按照5行×5列，共25个孔的规格进行接种，共接种4个板。细胞培养24小时后，吸净培养液，每一列为一组，实验组分别用含2%血清浓度的50ng/ml、75ng/ml、100ng/mlIGF-1培养液继续培养，对照组用含2%血清浓度的培养液培养，每三天更换一次培养液，分别于第1天、第3天、第5天、第7天采用MTT法检测细胞的体外增殖情况。MTT法检测具体如下：每孔加20μl甲基噻唑基四唑(Methyl Thiazolyl Tetrazolium, MTT)，4小时后吸净培养液，每孔加150μl二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)溶液,酶标仪以450nm波长检测各孔吸光度（OD）值。
　　2.人牙髓细胞在裸鼠体内的增殖分化情况1)人牙髓细胞接种于脱细胞真皮基质（acellular dermal matrix,ADM）支架：将 ADM支架置于灭菌好的生物安全柜中，裁剪成1cm×1cm×1cm大小，放入48孔板中，加入100μl胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）预湿，并放置于CO2恒温箱中24小时，24小时后吸净培养液备用。选取第四代人牙髓细胞，制备成2×105个/ml人牙髓细胞悬液，采取点种接种的方式将人牙髓细胞接种到ADM支架上，静置半小时，使人牙髓细胞充分进入到ADM支架的孔隙中，再加入含100ng/mlIGF-1的矿化液（含10%FBS的 DMEM，10mmol/Lβ-甘油磷酸钠，100mg/ml维生素C,10nmol/L地塞米松）1ml，培养3天；2) ADM支架移植到裸鼠体内：选取4周龄的免疫缺陷鼠，在无菌条件下切开其左背部皮肤，血管钳钝性分离，伤口长约1cm，将用含100ng/mlIGF-1的矿化液培养过3天的ADM支架-人牙髓细胞复合体移植到裸鼠左背部皮下，并拉拢缝合，该侧为实验侧；同样方法切开右侧背部皮肤，钝性分离，将空白支架移植到裸鼠右背部皮下，并拉拢缝合，该侧为对照侧。饲养2周后麻药过量处死一半裸鼠，饲养4周后麻药过量处死另一半。处死后立即将裸鼠体内支架复合物取出，部分进行冰冻，然后切片，进行HE染色，茜素红染色，Masson三色法染色，于光学显微镜下观察。部分支架复合物立即放入4%戊二醛溶液中固定，制备超薄切片，透射电镜观察；3)用SPSS21.0统计软件，数据结果以均数±标准差表示，采用单因素方差分析及S-N-K法进行统计学分析，P<0.05为有统计学意义。
　　结果：
　　1.通过组织块酶解法，在体外成功分离并培养出了人牙髓细胞，免疫组化法结果提示波形丝蛋白染色阳性，角蛋白染色阴性，证实人牙髓细胞来源于中胚层间充质细胞。
　　2.通过MTT法检测IGF-1不同浓度（50～100ng/ml）对人牙髓细胞增殖的影响，结果为人牙髓细胞培养至第5天和7天时，IGF-1组增殖均高于对照组（P<0.05），并随着浓度的升高，细胞增殖越明显，100ng/mlIGF-1组细胞增殖最显著（P<0.01）。
　　3.将ADM支架-牙髓细胞复合物移植到裸鼠体内后，分别培养2周、4周后，取出支架-细胞复合物部分进行冰冻切片：HE染色，可见大量的成纤维细胞；茜素红染色能够看见明显的矿化结节；Masson三色法染色提示蓝染的胶原纤维。
　　4.将在裸鼠体内培养了2周、4周后的ADM支架-细胞复合物取出，制备成超薄切片，采用透射电镜观察，结果显示：细胞内大量线粒体，高尔基体复合物，同时能够看到胶原纤维。
　　结论：
　　1.通过组织块酶消化法成功培养出了人牙髓细胞，经过免疫组化法鉴定细胞来源于中胚层间充质干细胞，选取增殖能力强，细胞形态好的第四代人牙髓细胞作为种子细胞，符合实验要求。
　　2.人牙髓细胞对IGF-1具有浓度依赖性，在50ng/ml～100ng/ml浓度范围促增殖作用明显，且IGF-1为100ng/ml浓度时，细胞增殖最明显。
　　3.ADM支架-人牙髓细胞复合物经裸鼠体内培养后，制备冰冻切片及超薄切片，经光学显微镜观察及透射电镜，证实IGF-1可以在体外及裸鼠体内促进人牙髓细胞的增殖分化。

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前言

材料与方法

1材料

2实验方法

结果

1人牙髓细胞的分离和培养

2 HDPCs组织学来源鉴定

3 IGF-1对人牙髓细胞体外增殖能力的影响

4动物实验结果分析

附图

附表

讨论

1本实验采用人牙髓细胞作为种子细胞

2 IGF-1作为生长因子促进人牙髓细胞增殖分化

3 ADM支架

结论

参考文献

综述: 支架在牙髓再生中的应用

致谢

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