亚胺培南诱导肺炎克雷伯菌产生耐药及耐药机制的研究

摘要

目的：通过分析亚胺培南诱导肺炎克雷伯菌的耐药特征探讨 AmpC酶和ompK35蛋白在亚胺培南诱导肺炎克雷伯菌耐药机制中的作用。
　　肺炎克雷伯菌（Klebsiella Pneumoniae，KPN）是临床分离及医院感染的重要致病菌之一，于1893年从大叶性肺炎患者的肺组织中首次分离到，可引起肺炎、尿路感染、败血症、伤口感染、脑膜炎等多种疾病，现已成为医院感染的重要病原菌。由于抗菌药物的大量使用，使肺炎克雷伯菌的耐药十分普遍，碳青霉烯类抗生素是治疗多重耐药肺炎克雷伯菌的最强效的抗生素，包括亚胺培南、美洛培南等。然而，随着碳青霉烯类抗生素的大量使用，全球许多地区出现了碳青霉烯类耐药的肺炎克雷伯菌感染的报道，给临床和治疗造成了极大困难。在国内，研究亚胺培南诱导肺炎克雷伯菌耐药报道的还不是很多，因此本课题有一定的创新性。
　　方法：
　　1、收集标本
　　分离临床收集肺炎克雷伯菌株共240株。在我院，培养标本主要集中在重症监护病房、神经外科病房、神经内科病房、呼吸科病房，泌尿外科病房等。由于抗生素的大量使用，以上几个病区肺炎克雷伯菌的鉴定率和耐药率都比较高，所以菌株收集主要来源于以上几个病区。
　　2、检测方法及监测指标
　　首先采用K-B法测定10种临床常用抗生素的耐药情况，所选取的药物有哌拉西林、亚胺培南、庆大霉素、氨曲南、头孢他啶、左旋氧氟沙星、阿米卡星、头孢吡肟、环丙沙星和多黏菌素B，并提取亚胺培南耐药的肺炎克雷伯菌株。其次采用琼脂稀释法检测亚胺培南最低抑菌浓度。然后采用三维实验的方法分析亚胺培南耐药的肺炎克雷伯菌所产β-内酰胺酶的类型。针对肺炎克雷伯菌株，采用普通 PCR方法检测 ompK35基因，采用多重 PCR的方法检测质粒携带的 AmpC酶基因，用荧光定量RT-PCR方法检测 ompK35基因表达情况；同时对产 AmpC酶的肺炎克雷伯菌用 RT-PCR方法检测AmpC酶基因的表达量情况。
　　3、统计方法
　　所有的数据显示，均数±标准差。单因素方差分析和 t检验进行组间差异分析。当P值小于0.05时，其差异有显著性。
　　结果：
　　1、针对240株肺炎克雷伯菌，所选取的临床常用的抗菌药物有哌拉西林、亚胺培南、庆大霉素、氨曲南、头孢他啶、左旋氧氟沙星、阿米卡星、头孢吡肟、环丙沙星和多黏菌素 B10种药物进行耐药实验，结果显示肺炎克雷伯菌对这些药物的耐药率依次为：39.18％，35.36%，34.45%，32.18%，30.36%、28.72%、27.39%、24.90%，13.72%和0%。
　　2、在240株肺炎克雷伯菌株中，共检测到48株产β-内酰胺酶菌株，β-内酰胺酶的检出率20.00%(48/240)。其中产AmpC酶的菌株共有25株（52.08%），产金属酶的菌株有4株（8.33%），产ESBL的菌株有11株（22.92％），同时产AmpC酶和超广谱β-内酰胺酶的有3株（6.25%）；还有5株菌（10.42％）的产酶类型有待分析。通过三维水解实验检测结果发现，有7株菌所产的AmpC酶对IMP有一定的水解作用。
　　3、 PCR、多重PCR检测肺炎克雷伯菌IMP耐药结果显示，在产AmpC酶的菌株中，AmpC酶的基因含量均有不同程度的增加，其中最少增加4.44倍，最多增加354.59倍。90株IMP耐药的KP菌株中，ompK35基因检测为阴性的菌株有40株，占IMP耐药KP菌株总数的44.44%(40/90)，阳性菌株有50株，占总数的55.56%(50/90)。
　　4、在荧光定量RT-PCR对IRKp的ompK35基因表达蛋白量的检测中，25株产AmpC酶KP菌株中，12株菌ompK35基因表达量减低，13株菌ompK35基因表达量正常；在25株产AmpC酶的KP菌株中微弱水解IMP的菌株有7株，其AmpC酶基因的表达量均有明显升高，其中5株菌同时伴有ompK35基因表达量降低。
　　结论：
　　1、亚胺培南能诱导肺炎克雷伯菌产生耐药。
　　2、 AmpC酶的存在是导致KP对IMP耐药的一个重要因素，其水解活动可能在耐药机制中起到重要作用。
　　3、 OmpK35表达量降低是KP对IMP耐药的重要原因之一。

目录

封面

目录

中文摘要

英文摘要

英文缩写

前言

材料与方法

1 材料

2 方法

结果

1 临床采集肺炎克雷伯菌株对10种常用抗菌药物的耐药率

2 琼脂稀释法结果

3 经琼脂稀释法筛选得到的90株耐IMP肺炎克雷伯菌对其它抗生素的药敏结果

4 菌株检测结果

5三维水解实验检测结果

6 肺炎克雷伯菌基因组 DNA 电泳结果

7 PCR和多重PCR检测结果

8 荧光定量RT-PCR结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述:产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌

致谢

个人简历