细丝蛋白A影响EGFR突变阳性非小细胞肺癌厄洛替尼治疗的敏感性

摘要

目的：肺癌长期以来是全球癌症相关死亡的首要原因。肺癌中最常见的亚型是非小细胞肺癌（NSCLC），约占80％。总体来说，NSCLC治疗效果不尽如人意。尽管化疗取得了很大进步，但即使最有效的以铂类为基础的新一代的化疗方案也只使中位总生存期（OS）延长至最多10个月。通过对NSCLC发生、发展的基础分子事件的深入研究，表皮生长因子受体（EGFR），一类酪氨酸激酶受体，成为NSCLC治疗方案中一个重要靶标。它们可与EGFR或其它HER家族成员结合形成二聚体，在关键的酪氨酸残基上发生自身磷酸化，进一步激活一系列下游信号通路如PI3K/AKT/mTOR，RAS/RAF/MAPK，JAK/STAT，这对调节细胞内多个程序包括增殖，存活和凋亡起重要作用。EGFR信号通路的激活由基因突变或（和）基因扩增引起，已证实它们与NSCLC的发生，进展和不良预后关系密切。EGFR激活突变主要位于酪氨酸激酶区域，以19外显子碱基对缺失或21外显子点突变的形式发生，这可见于约20%的NSCLC患者。这些突变使EGFR激活，进而激活其下游的信号分子。第一代EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs），吉非替尼和厄洛替尼，可逆的竞争ATP结合位点从而阻断EGFR诱导的下游信号通路的激活，在NSCLC的治疗中广泛应用。大量研究表明EGFR突变阳性的NSCLC患者应用吉非替尼或厄洛替尼对比卡铂/紫杉醇可显著延长中位无病进展生存期（PFS），明显改善生活质量，延缓症状恶化。然而，仍有约30%EGFR突变阳性的患者对EGFR-TKIs不敏感。因此，探讨影响肿瘤细胞对EGFR-TKI敏感性的分子机制，对临床合理选择治疗NSCLC药物及判断药物疗效具有重要意义。细丝蛋白A（FLNa)，同时也称肌动蛋白结合蛋白280(ABP280)，最初被认为是一种非肌动蛋白细丝交联蛋白。随后报导说明了此蛋白在细胞收缩和伸展中具有重要作用。FLNa作为重要脚手架分子，促进蛋白-蛋白之间的相互作用并影响蛋白细胞定位。研究证实FLNa凝结蛋白参与细胞信号转导，在多种类型癌组织过表达，由于其与肿瘤发生相关， FLNa在肿瘤细胞中的作用已成为研究热点。Zhu等已经证实降低FLNa的表达可促进肺腺癌PC-9细胞的增殖、迁移和侵袭。FLNa可抑制PC-9细胞EGFR及其下游MAPK/ERK信号转导通路激酶的活化，增强吉非替尼对PC-9细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用。厄洛替尼与吉非替尼两药有相同的喹唑啉母环，吉非替尼侧链不对称，而厄洛替尼的侧链是镜像对称的，结构上的细微差异导致两药物在血浆内，肿瘤组织内的分布，代谢，体外活性，毒性等方面有所不同。这对于不同药物对各种不同肿瘤的治疗选择上有重要参考意义。两药结构的不同是否导致与FLNa相互作用的不同，进而影响EGFR突变阳性非小细胞肺癌对厄洛替尼的敏感性，有待进一步验证。
　　方法：⑴Western bolt方法检测稳定转染细胞株中FLNa蛋白水平。⑵MTS比色分析法检测厄洛替尼对稳定转染细胞增殖能力的影响。⑶划痕修复实验检测厄洛替尼对稳定转染细胞迁移能力的影响。⑷侵袭试验检测厄洛替尼对稳定转染细胞侵袭能力的影响。⑸Western blot检测厄洛替尼对稳定转染细胞 filamin A，p-EGFR， EGFR，p-ERK，和ERK水平，β-actin作为内参。
　　结果：①采用Western blot检测稳定转染细胞FLNa蛋白水平，ImageJ软件对蛋白条带进行扫描，利用 SPSS13.0软件进行统计分析，结果：PC-9/ctrl细胞中 FLNa的表达量（0.87±0.01）明显高于 PC-9/FLNa（KD）细胞（0.25±0.01），差异具有统计学意义（P<0.01）。②MTS法检测稳定转染细胞IC50，结果：不同浓度的厄洛替尼作用下，其对PC-9/ctrl细胞的生长抑制率均高于PC-9/FLNa（KD）细胞，差异有统计学意义（P<0.05）；厄洛替尼的 IC50值，PC-9/FLNa（KD）组细胞（0.39±0.01）明显高于PC-9/ctrl组细胞（0.08±0.01），差异具有统计学意义（P<0.01）。PC-9/FLNa（KD）细胞对厄洛替尼的敏感性更低。③用划痕修复实验检测两组细胞的迁移能力，结果：无药物作用时， PC-9/FLNa（ KD）组细胞在6h、12h、18h的迁移率（16.49±0.86%，43.32±0.95%，50.00±0.00%）均明显高于 PC-9/ctrl组（11.58±1.50%，28.68±1.48%，50.00±0.00%），差异均有统计学意义（P<0.05）；0.04μmol/L厄洛替尼作用时， PC-9/FLNa（ KD）组细胞6h、12h、18h的迁移率（12.92±1.44%，30.35±1.07%，49.98±0.02%）明显高于 PC-9/ctrl组细胞（6.36±0.99%，18.48±1.10%，24.22±0.05%），均有统计学意义（P<0.05）。④侵袭试验检测结果：无药物作用时，PC-9/FLNa（KD）组穿膜的细胞数量(125.00±5.72)多于PC-9/ctrl组(63.00±5.46)，在0.04μmol/L厄洛替尼作用下的 PC-9/FLNa（KD）组穿膜的细胞数量(86.00±4.09)明显多于PC-9/ctrl组(29.00±3.21)，差异均有统计学意义（P<0.01）。⑤Western blot检测0.01μmol/L厄洛替尼作用于两组细胞0h、2h、4h后各蛋白的表达水平，结果：PC-9/FLNa（ KD）组 p-EGFR的水平（0.37±0.01；0.31±0.01；0.28±0.00）均明显高于PC-9/ctrl组（0.33±0.01；0.03±0.00；0.11±0.00），差异具有统计学意义（P<0.05）；PC-9/FLNa（KD）组p-ERK的水平（0.98±0.00；0.57±0.00；0.79±0.01）均高于PC-9/ctrl组（0.89±0.01；0.25±0.01；0.45±0.01），差异均有统计学意义（P<0.05）。
　　结论：⑴下调FLNa的表达促进PC-9细胞的增殖、迁移和侵袭；FLNa通过影响PC-9细胞EGFR的磷酸化水平，调控MAPK/ERK激酶的活化，进而影响PC-9细胞的生物学行为。⑵FLNa抑制PC-9细胞EGFR及其下游MAPK/ERK信号转导通路激酶的活化，增强厄洛替尼对PC-9细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用。

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前言

材料与方法

1 材料

2方法

3统计学处理

结果

1稳定转染细胞FLNa蛋白水平

2两组细胞对厄洛替尼的敏感差异

3 EGFR活化水平及其下游信号分子的表达水平

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述:细丝蛋白A与肿瘤

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