RhoA-ROCK信号通路在氯胺酮致发育期海马神经元的神经毒性机制研究

摘要

第一部分原代海马神经元的培养、形态学观察以及纯度鉴定
　　目的：
　　通过对新生24h内S D大鼠海马神经元培养，掌握大鼠海马神经元体外培养的方法，利用免疫荧光细胞化学鉴定神经元纯度。
　　方法：
　　取新生24 h内的S D乳鼠，用75％乙醇消毒，剪断头，分层剪开皮肤和颅骨，用弯镊取出大脑，置于预冷的DMEM液中，快速剥离出两侧海马组织，在解剖显微镜下去除海马的血管和被膜，用显微剪把组织剪碎，再移入木瓜蛋白酶和DNA酶Ⅰ的混合消化液中，置于37℃，5％CO2培养箱中消化30 min。用吸管将组织块移入含有10％胎牛血清的DMEM液中终止消化5min，再把组织块移入接种培养基中，用1ml长枪头匀速、轻柔地反复吹打，直至液体变浑浊，没有块状物质，之后过200目的细胞筛。在显微镜下进行活细胞计数，制成1x106／ml密度的细胞悬液，种植于多聚赖氨酸处理过的6孔培养板中，每孔加2.5ml，置于37℃，5％CO2的培养箱内培养。6h后全量更换无血清的维持培养基。以后，每隔一天半量换液一次。在第四天的时候，加入终浓度10mM的5fu和尿嘧啶，来抑制胶质细胞的生长。在显微镜下观察神经元的生长情况。海马神经元培养7d后，应用免疫荧光化学技术，用荧光标记的MAP-2标记神经元， DAPI标记所有细胞的细胞核。在荧光显微镜下，随机选取5个孔，分为5组，分别在低倍视野（4×10）和高倍视野(10×20倍)下观察，拍照。计数神经元和所有细胞核的数目，并计算神经元所占的百分比，取均值作为每孔神经元纯度。
　　结果：
　　原代培养海马神经元，神经元标志物单克隆神经元微管相关蛋白-2（MAP-2）抗体和核抗体DAPI荧光染色后，在荧光倒置显微镜下鉴定，计算海马神经元纯度约为（91.52±1.70）%。
　　小结：
　　体外培养的原代SD新生乳鼠海马神经元形态典型，且海马神经元纯度在90％以上，能够满足进一步的实验要求。
　　第二部分不同浓度的氯胺酮对海马神经元树突棘的影响
　　目的：
　　观察不同浓度氯胺酮对发育期海马神经元树突棘的影响。
　　方法：
　　取原代培养至第5d的海马神经元，随机分为4组：①C组（空白对照组）：加入等体积的维持培养基②K1组：加入氯胺酮，终浓度为100μM③K2组：加入氯胺酮，终浓度为300μM④K3组：加入氯胺酮，终浓度为500μM。各组继续培养6小时后，固定，用荧光染料V22888染色。之后，在共聚焦显微镜下观察，随机摄取荧光图片，并计算各组神经元树突棘的密度以及平均长度。
　　结果：
　　1树突棘的密度（F=13.298，P=0.002）：K2组及K3组与C组比较，数值有所降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；K1组与C组比较，差异无统计学意义。K3组与 K2组比较，数值有所降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；
　　2树突棘的平均长度（F=30.440，P=0.000）：K2组及K3组与C组比较，数值有所降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；K1组与C组比较，差异无统计学意义。K3组与K2组比较，差异无统计学意义。
　　小结：
　　氯胺酮对海马神经元树突棘的影响具有剂量依赖性。随着氯胺酮浓度的升高，其对树突棘的损伤也越明显，其神经毒性作用就越强。
　　第三部分氯胺酮对原代培养海马神经元的神经毒性的作用机制
　　目的：
　　1应用 Westem blot技术检测使用氯胺酮后 RhoA及其下游分子ROCK的表达量的变化，以及使用Y-27632后RhoA和ROCK蛋白表达的变化。
　　2应用免疫荧光细胞化学技术标记神经元树突棘，阐明RhoA-ROCK信号通路在氯胺酮对原代培养的海马神经元毒性中的作用。
　　方法：
　　取原代培养至第5d的海马神经元，随机分为4组：①C组（空白对照组）：加入等体积的维持培养基②Y组：加入 Y-27632，终浓度为10μM③K组：加入氯胺酮，终浓度为300μM④K+Y组：加入氯胺酮和Y-27632，终浓度分别为300μ M和10μM。
　　1将各组再培养6小时后，提取蛋白，应用Westernblot技术检测各组RhoA和ROCK蛋白表达的变化。
　　2将各组再培养6小时后，用V22888染色，在共聚焦显微镜下观察各组神经元树突棘的变化。
　　结果：
　　1 RhoA（F=404.774，P=0.000）：Y组与C组比较，RhoA蛋白表达量差异无统计学意义；K组与C组比较，RhoA蛋白表达表达显著增高，且有统计学意义（P<0.05）。K+Y组与K组比较，RhoA蛋白表达量差异无统计学意义；
　　2 ROCK（F=721.413，P=0.000）：Y组与C组比较，ROCK蛋白表达量差异无统计学意义；K组与C组比较, ROCK蛋白表达表达显著增高，且有统计学意义（P<0.05）。K+Y组与K组比较，ROCK蛋白表达量显著降低，且差异有统计学意义（P<0.05）；
　　3树突棘的密度（F=11.383，P=0.003）：Y组与C组比较，差异无统计学意义；K组与C组比较，数值有所降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。K+Y组与K组比较，数值有所升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；
　　4树突棘的平均长度（F=26.152，P=0.000）：Y组与C组比较，差异无统计学意义；K组与C组比较，数值有所降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。K+Y组与 K组比较，数值有所升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　小结：
　　1氯胺酮可通过激活RhoA-ROCK信号转导通路损伤神经元树突棘，并发挥其神经毒性作用。
　　2 Y-27632可减轻氯胺酮对树突棘的损伤，减弱氯胺酮的神经毒性作用，从而起到神经保护作用。
　　结论：
　　氯胺酮可通过RhoA-ROCK信号转导通路发挥神经毒性作用。

目录

声明

英文缩写

引言

第一部分原代海马神经元的培养、形态学观察及纯度鉴定

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分不同浓度的氯胺酮对海马神经元树突棘的影响

前言

材料与方法

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分RhoA-ROCK信号通路在氯胺酮致发育期海马神经元的神经毒性机制研究

前言

材料和方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述:全身麻醉药对发育期大脑的影响

致谢

个人简历