不同补片对体外培养人胎肺成纤维细胞增殖和胶原蛋白合成功能的影响

摘要

腹外疝是临床上的常见病和多发病，随着外科材料学的发展，无张力疝修补术日益增多，现已成为外科临床的常规技术，补片质量也成为影响手术复发率及并发症发生率的重要因素之一。 就补片品质而言，其主要影响因素有两个方面，1：补片的生物相容性，2：补片对体内成纤维细胞胶原合成的影响。对于前者，补片的生产厂家都已做了大量详实的相关研究，有许多资料可供参考，而后者我们可以获得的资料甚少。为此，本研究就临床上最常用的三种不材质的补片，进行体外实验研究，希望能获得相关数据，以期为疝外科临床提供有益的帮助。 研究目的： 1、观察不同材质的补片在体外同一条件下对人成纤维细胞的增殖、凋亡的影响。 2、观察不同材质的补片在体外同一条件下对人成纤维细胞胶原合成的影响。 实验方法： 1、实验分组 本研究分4组及正常对照组、聚丙烯组(PP组)、聚酯组(PE组)和膨化聚四氟乙烯组(ePTFE组)。正常对照组为在培养的成纤维细胞中不加入补片，三个实验组分别加入聚丙烯补片(PP组)、膨化聚四氟乙烯补片(ePTFE组)和聚酯补片(PE组)。其他培养条件完全相同。 2、观察指标及方法 2.1人成纤维细胞(HFL1)的培养和传代 按照American Type Culture Collection(ATCC)要求，用含10％FBS的DMEM培养基(包含青霉素100U/mL，链霉素100μg/mL)于37℃在含5％CO2的培养箱内培养，每2-3天传代，取第四代增殖状态良好的细胞实验。 2.2细胞增殖实验(MTT法) 将贴壁培养的人成纤维细胞消化分离计数，用含10％FBS的DMEM培养液稀释到1×105/ml，接种于24孔板，每孔0.5ml，依次用含10％和1％的FBS的DMEM培养基分别培养24和12小时，最终改用无血清DMEM培养基进行实验，并分别加入大小为1.0cm×1.0cm的三种补片，在补片上压以长1.0cm，直径2mm的钛丝以防止补片浮起，继续培养48小时直接加入100ulMTT试剂，37℃孵育4小时，吸出800ul培养基，每孔加入500ul二甲基亚砜，于室温下震荡15分钟，使结晶物充分溶解。用酶标仪在492nm处测量各孔的吸光度。细胞增殖情况用各孔的吸光度表示。 2.3细胞周期测定(流式细胞术法)： 以S期细胞指数(SPF)及凋亡细胞比例观察各补片对细胞周期的影响。 首先将人成纤维细胞消化分离计数，用含10％FBS的DMEM培养液稀释到1×105/ml，接种子12孔板，每孔1ml，依次用含10％和1％的FBS的DMEM培养基分别培养24和12小时，然后改用无血清DMEM培养基，并分别加入大小为1.5cm×1.5cm的三种补片，在补片上压以长1.5cm直径2mm的钛丝以防止补片浮起，继续培养48小时，以0.05％胰酶消化细胞、血清中和后收集细胞，1000转/分离心5分钟，并用PBS洗涤离心三次，最后一次离心后弃去大部分PBS，仅保留约0.5ml，加入70％冷乙醇2ml固定，4℃过夜后，离心弃去乙醇，PBS洗涤，1000rpm离心10分钟，RNase A(0.5mg/ml)37℃消化30分钟，PI(50mg/ml)染色，室温避光30分钟，上机检测，设定激发光波长为488nm．细胞增殖情况由S期细胞指数(SPF)表示，S期指数(SPF)=S/(G0/G1+S+G2/M)×100％．细胞凋亡情况由凋亡细胞百分比表示，为凋亡细胞的数量/总的计数细胞的数量。 2.4人成纤维细胞胶原合成功能的检测(羟脯氨酸测定法)：胶原蛋白总量以羟脯氨酸浓度表示，检测采用消化法，严格按照羟脯氨酸测定试剂盒的要求进行操作，其过程简述如下。将人成纤维细胞消化分离计数，用含10％FBS的DMEM培养液稀释到1x105/ml，接种于12孔板，每孔1ml，依次用含10％和1％的FBS的DMEM培养基分别培养24和12小时，然后改用无血清DMEM培养基，并分别加入大小为1.5cmx1.5cm的三种补片，在补片上压以长1.5cm直径2mm的钛丝防止补片浮起。继续在相同条件下培养48小时。吸去上清，PBS洗涤，胰酶充分消化、中和、吹打，收集细胞，并使用PBS洗涤各孔三次，收集洗涤液，将上述液体，于3000转/分离心15分钟，弃上清，并加入纯水1000ul，初步破碎细胞，然后用超声细胞破碎仪充分破碎，上述破碎后的液体，于3500转离心10分钟，吸取上清0.5ml，以纯水为空白管、2ug/ml的羟脯氨酸标准应用液为标准管，用751紫外分光光度计于550nm测定各管吸光度，并算出羟脯氨酸浓度。计算公式，羟脯氨酸浓度=((测定管吸光度—空白管吸光度)/(标准管吸光度—空白管吸光度))×2.0。 3、统计学处理 采用SPSS16.0软件，就上述观察指标进行分析，数据以平均值±标准差表示，统计方法使用成组设计的方差分析(One—Way ANOVA)，组间比较，方差齐性检验，方差齐则使用S—N—K法，方差不齐时使用Dennett's T3法。所有的显著性水平(P值)均为0.05。 结果： 1、细胞增殖实验(MTT法)：正常对照组较三个补片组的吸光度为高，差异存在显著性(P<0.05)。表明三种补片对成纤维细胞增殖均有影响，PP组较PE组为高，差异有显著性(P<0.05)，ePTFE组与PE组、PP组之间差异无显著性(P>0.05)。 2、人成纤维细胞S期指数(SPF)：组间两两比较PE组、ePTFE组较PP组、正常对照组S期细胞指数为高，其差异存在显著性(P<0.05)。PE组和ePTFE组之间差异并无显著性(P=0.053)，聚丙烯补片组、正常对照组之间差异也无显著性(P＝0.27)。 3、凋亡细胞比例：经统计分析，本研究的细胞凋亡数据组间方差不齐，故组间比较使用Dennett's T3法，PE、ePTFE组较PP片组、正常对照组的凋亡细胞比例为高，其差异存在显著性(P<0.05)。PE组和ePTFE组之间差异无显著性(P>0.05)，PP组、正常对照组之间差异无显著性(P>0.05)。 4、细胞胶原蛋白合成水平：正常对照组羟脯氨酸浓度最高，为1.70±0.15；其次为PP组，为1.61±0.18；PE组再次，ePTFE组最低。但是，正常对照组和PP组之间差异无显著性(P=0.184)；正常对照组较PE组及ePTFE组高，差异有显著性(P<0.05)；PE组和ePTFE组之间差异无显著性(P>0.05)。 结论： 本研究发现： 1：三种不同材质的补片对体外培养条件下的人成纤维细胞的增殖均有一定的影响。 2：单股编制的聚丙烯网片，对体外培养的人成纤维细胞无论是增殖、凋亡成还是胶原蛋白合的影响均较小。 3：在体外条件下，膨化聚四氟乙烯补片和聚酯补片有轻度促进细胞增殖的作用，同时也明显增加细胞的凋亡，二者互相抵消，总体上对成纤维细胞也呈负面影响。

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前言

实验方法

结 果

讨论

结 论

参考文献

附录

致谢