SLE患者血清对骨髓间充质干细胞生长、增殖、凋亡及细胞因子的影响研究

摘要

1．研究目的： 红斑狼疮（Iupus erythematosus，LE）是一种多见于15～40岁女性、临床上有多种表现、可累及全身任何脏器的自身免疫性结缔组织病。红斑狼疮是一个病谱性疾病，病谱的一端为盘状红斑狼疮（discoid lupus erythematosus，DLE），病变主要限于皮肤，另一端为有内脏多系统受累、并常有皮肤损害的系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）。SLE临床表现多种多样，血液系统主要表现为贫血、白细胞减少、血小板减少及血沉增快，其免疫学特征主要是高滴度的自身抗体和伴随T淋巴细胞减少的自身反应性淋巴细胞增多。 间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是骨髓微环境中具有多种分化倾向、高度增殖及自我更新能力的非造血性干细胞，参与造血微环境形成，调控造血功能。MSCs是造血微环境中的重要成分，不仅起支持作用，而且分泌细胞因子，调节造血细胞增殖分化。 目前SLE的发病机理尚未完全阐明，以往研究多数着重于T、B淋巴细胞亚群比例失调或功能异常、细胞因子及其受体的改变等方面。近年用异体骨髓移植治疗SLE患者，用正常的造血干细胞代替患者的病态干细胞，重建SLE患者的免疫细胞及血细胞，有可能根治SLE。此外有文献报道雌性狼疮鼠骨髓CFU—GM明显减少，SLE患者T淋巴细胞形成能力下降，均提示SLE可能是干细胞疾病。最近有研究发现SLE患者的MSCs存在异常，发现SLE的发生、发展与造血微环境有很大的关系。本研究希望通过探讨MSCs与SLE患者血液系统损害的关系，为该病的发病机理提供新的依据。 2．研究方法： 本试验共分为三组：①SLE活动期患者血清/MSCs组（11人）；②SLE非活动期患者血清/MSCs组（13人）；③正常人（对照组）血清/MSCs组（11人）。所有SLE患者均符合美国风湿病学会1982年制定的分类诊断标准，入院前均未使用激素和免疫抑制剂治疗。SLE活动指数（SLEDAI评分）≥10分的患者进入活动期组，SLEDAI评分<10分的患者进入非活动期组。对照组为我院门诊健康体检者。 抽取SLE患者及正常人的外周血后分离提取血清，制成含10％人血清的DMEM/F12完全培养基。观察SLE患者血清对MSCs的生长、增殖及相关细胞因子的分泌的影响，方法步骤如下： 2．1 MSCs分离、纯化、传代及鉴定 2．2取P5代MSCs，用含10％人血清的DMEM/F12完全培养基重新悬浮细胞，进行培养。通过培养观察间充质干细胞的细胞生物学变化： 2．2．1绘制细胞生长曲线 2．2．2 MTT法检测细胞增殖 2．23流式细胞仪检测细胞凋亡 2．3取P5代MSCs，用含10％人血清的DMEM/F12完全培养基重新悬浮细胞，进行培养。观察MSCs分泌的细胞因子IL—6、IL—7、SCF的变化： 2．3．1利用RT—PCR技术检测MSCs分泌的细胞因子IL—6、IL—7、SCF在mRNA水平的变化。 2．3．2利用Western blot技术检测MSCs分泌的细胞因子IL—6、IL—7、SCF在蛋白水平的变化。 3．研究结果： 3．1 MSCs可以黏附到塑料瓶底部生长，形态呈长梭形。MSCs表型为CD29和CD44阳性，而CD45、CD106、CD71、CD34为阴性；体外培养的MSCs表面CD166的表达则不稳定，部分标本呈阳性，部分则呈阴性。 3．2 MSCs的细胞生物学变化的比较 3．2．1分别对三组培养MSCs绘制生长曲线，发现三组细胞的增长曲线基本相同，未见明显的差别； 3．2．2通过MTT法分别检测三组培养MSCs的细胞增殖，发现三组细胞的增殖基本相同，未见明显的差别； 3．2．3通过流式细胞仪分别检测三组培养MSCs的细胞凋亡。与正常对照组相比，SLE活动期组和非活动期组凋亡细胞数增多，具有统计学意义（P<0．05）。两组之间比较，SLE活动期组凋亡细胞数目较非活动期组增多（P<0．05）。 3．3 RT—PCR结果 3．3．1 IL—6：与正常对照组相比，SLE活动期组和非活动期组IL—6 mRNA在MSCs中表达显著降低，具有统计学意义（P<0．05）。SLE活动期组和非活动期组之间比较无统计学差异（P>0．05）。 3_3．2 IL—7： SLE活动期组IL—7 mRNA在MSCs中表达较正常对照组显著降低，具有统计学意义（P<0．05）。SLE活动期组和非活动期组之间比较无统计学差异（P>0．05）。 3．3．3 SCF：三组之间SCF mRNA在MSCs中表达存在显著的差异，SLE活动期组<非活动期组<正常组，具有统计学意义（P<0．05），特别是SLE活动期组与正常对照组之间的差异非常显著（P<0．01）。 3．4 Western blot结果 3．4．1 IL—6：三组MSCs均分泌IL—6，与正常对照组相比，SLE活动期组和非活动期组MSCs分泌IL—6显著降低，具有统计学意义（P<0．05）。SLE活动期组和非活动期组之间比较无统计学差异（P>0．05）。 3．4．2 IL—7：三组MSCs均分泌IL—7，与正常对照组相比，SLE活动期组及非活动期组MSCs分泌IL—7显著降低，具有统计学意义（P>0．05）。SLE活动期组和非活动期组之间比较无统计学差异（P>0．05）。 3．403 SCF：三组MSCs均分泌SCF，SLE活动期组及非活动期组SCF的表达显著降低，且三组之间分泌SCF存在显著的差异，具有统计学意义（P<0．05），特别是SLE活动期组与正常对照组之间的差异非常显著（P<0．01）。 4．研究结论： SLE患者的血清能使正常人MSCs细胞凋亡增加，抑制正常MSCs分泌L—6、IL—7及SCF。并且SLE患者的血清对细胞凋亡及SCF分泌的影响可能与患者病情的活动度有关。实验结果提示SLE患者的血清可引起正常MSCs发生继发性损害。

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